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由子囊菌苹果黑腐皮壳(Valsa mali)引起的苹果第一大病害——苹果树腐烂病在我国分布广泛,危害严重,造成了巨大的经济损失。大量的研究证明,病菌分泌的效应蛋白能够促进病原菌侵染,因此,从组织细胞学角度研究寄主与病菌的互作过程,在微观层面解析效应基因作用机理,对揭示腐烂病菌致病机理具有重要意义。在前期研究中,课题组从腐烂病菌候选效应蛋白中筛选获得了一个细胞坏死抑制子(cell death suppressor)Vm EP1,以及一个细胞坏死激发子(cell death elicitor)Vm E02。Vm EP1基因敲除突变体(ΔEP1)致病力下降50%,被证明是一个效应基因,Vm E02基因敲除突变体致病力虽未发生明显变化,然而其过表达突变体(OE-E02)致病力增加14.28%,也是一个效应基因。为探究V.mali侵染中两个效应蛋白在寄主组织和细胞形态变化方面发挥的作用,进行了两个效应基因突变体(ΔEP1及OE-E02)侵染苹果寄主的组织细胞学研究,所得结果和结论如下:1. 基于超薄切片-激光共聚焦扫描显微镜(Microtomy-CLSM)技术,构建了腐烂病菌侵染过程中与寄主互作的3D模型。本研究观察到了腐烂病菌在苹果枝条及叶片组织中拓展定殖的空间结构、被病原菌高度降解组织中病菌与寄主组织交联的空间结构和完整的纤维结构,并在此基础上构建了腐烂病菌与寄主互作的3D模型,解析了二者互作中组织内部精细化的结构,为后续研究病原菌的侵染提供更多依据和优化的实验技术支持。2. 比较研究发现,在侵染速率及对寄主组织破坏程度上,过表达突变体OE-E02菌株>03-8野生型菌株>敲除突变体ΔEP1菌株,且突变体菌株能更快更早引起寄主细胞壁增厚等免疫反应。接种1 d-5 d的寄主组织学切片观察发现,OE-E02菌株侵染速率最快,在接种后5 d导致寄主组织的完全水解;03-8野生型菌株次之;ΔEP1菌株最慢,5d引起寄主组织部分水解。细胞学观察发现,田间病枝寄主细胞出现了质壁分离、原生质凝结、细胞壁降解、细胞泡囊化、多种细胞器解体的现象,最终水解坏死;人工接种条件下,03-8菌株在距离接种中心1.0 cm/48 h发现寄主细胞壁增厚等免疫反应,ΔEP1菌株在0.5 cm/24 h、OE-E02菌株在0.5 cm/12 h和1.0 cm/12 h更快引起寄主细胞壁增厚等免疫反应。3. 突变体菌株ΔEP1及OE-E02菌株能更迅速引发了寄主体内的活性氧应答机制,累积更多的活性氧。为进一步研究寄主对ΔEP1和OE-E02菌株的应答反应,利用Mn2+/DAB沉淀法和Ce Cl3沉淀法分别对接种后12 h的苹果叶片细胞中超氧阴离子和过氧化氢(O2-、H2O2)进行细胞化学定位研究。结果发现突变体菌株ΔEP1菌株和OE-E02菌株侵染后寄主细胞膜系统、细胞壁内侧及外侧、细胞间隙、菌丝体周围均出现大量成片、连续的O2-、H2O2沉积形成的黑色沉淀;而03-8野生型菌株处理后,仅在寄主细胞膜上出现部分黑色的O2-沉淀,菌丝体周围未见O2-沉淀,在寄主细胞内外两侧出现少量颗粒状黑色H2O2沉淀,菌丝体周围几乎无H2O2沉淀。4. 突变体菌株ΔEP及OE-E02菌株诱导寄主更快、更强的免疫反应。为探究寄主在腐烂病菌侵染下自身免疫反应的变化,本研究对苹果寄主防卫基因的表达模式进行了分析。在苹果枝条上分别接种03-8野生型菌株、ΔEP1菌株、OE-E02菌株后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h取样分析,发现寄主的Md PDF1、Md NPR1、Md PR1、Md PR2均表现出显著的上调趋势,其中Md NPR1变化趋势相似。但是ΔEP1,OE-E02处理下寄主防卫基因峰值表达量大幅上调且Md PDF1、Md PR1、Md PR2基因峰值表达时间均早于03-8处理。03-8野生型菌株处理下Md PDF1、Md NPR1、Md PR1、Md PR2峰值出现在48 h、36 h、48 h、48 h;ΔEP1处理下四个防卫基因峰值均出现在36 h,其峰值分别为03-8菌株处理下的2.88倍、1.59倍、9.14倍、2.42倍;OE-E02处理下四个防卫基因峰值分别出现在24 h、36 h、36 h、24 h,其峰值分别为03-8菌株处理下的1.36倍、1.30倍、4.03倍、2.75倍。综上所述,本研究发现苹果树腐烂病菌两个效应基因突变体菌株ΔEP1及OE-E02可引起寄主更强的免疫反应,其中Vm EP1是一个重要的可以抑制寄主免疫应答的基因、Vm E02是一个重要的可以激发寄主免疫应答的基因。该研究为后续深入探究两个效应蛋白与寄主互作机理提供了一些重要依据。