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小麦是我国主要粮食作物之一,其年加工量达1亿吨左右,作为面粉工业副产品的麦胚年蕴藏量达200~400万吨,实际提胚量也有20万吨以上。合理开发利用麦胚不仅可为人类提供优质的营养素,消除麦胚混入面粉而产生的各种不良影响,而且提升了随麸皮作为廉价饲料出售的麦胚的经济价值,具有较大的社会效益和经济效益。
麦胚含有30%左右的蛋白质,是一种潜在的植物蛋白资源,目前国内外对麦胚蛋白的研究与开发尚停留在营养源水平上。麦胚是具有生命活力的植物胚胎,麦胚蛋白中蕴涵着许多具有生物活性的氨基酸序列,用特异的蛋白酶水解就有可能释放出有活性的肽段,利用麦胚蛋白研究和开发具有某种确切功能的生物活性肽不失为进一步开发麦胚蛋白的有效途径。
论文首先研究了麦胚蛋白酶解工艺,以体外抗氧化活性及抗肿瘤活性为考察指标,从5种商品蛋白酶中确定了酶解的最适水解酶为碱性蛋白酶ProleatherFG-F;通过单因素试验和响应面分析优化确定麦胚蛋白酶解物(wheatgermproteinHydrolysatesWGPHs)的最佳酶解条件为:[S]5.00%、[E]/[S]4.85%~4.95%、pH9.5、52.25℃~54.00℃、4.00h;最佳酶解条件下制备的WGPHs对O2-·的清除率和人小细胞肺癌株H446的增殖抑制率分别为55.85%(1.50mg/mL)和60.65%(0.25mg/mL),其相对分子质量主要分布在11563~130之间,其中相对分子质量小于3000的组分比例为83.30%,小于1000的组分比例为53.01%,峰值分子量为210的组分含量最高,约占30.65%。
尽管可以通过酶解工艺的优化而获得分子质量相对较为集中的组分,但蛋白质酶解液的成分仍然复杂多样,鉴于目前国内外热点研究的活性肽的相对分子质量(Mr)都在3000以下,所以有必要对WGPHs进行超滤分离。本研究采用的脱脂麦胚蛋白系碱提酸沉法制备,且水解过程不可避免地带入了一些盐分,这些盐分的存在不仅会影响最终产品的品质,且会干扰麦胚蛋白酶解物生理活性的分析,因此,论文研究了大孔吸附树脂对WGPHs的吸附性能和脱盐效果。结果表明:采用相对分子质量为3000的聚砜膜对WGPHs进行超滤分离的最适工艺条件为:操作压力0.30MPa,操作温度20℃,WGPHs浓度35g/L,超滤有效地除去了料液中相对分子质量较大的组分,清除O2-·的IC50由超滤前的1.64mg.mL-1降至超滤后的1.29mg.mL-1。DA201-C大孔吸附树脂对WGPHs的静态吸附与解吸的效果优于其它8种树脂;动态吸附解吸试验表明:50mg/mL的WGPHs以0.5BV/h流速上样、1BV/h的流速水洗、1.5mL/min的75%的乙醇解吸后,其脱盐率和回收率分别为92.25%、78.55%;大孔吸附树脂处理后WGPHs中疏水性氨基酸的摩尔百分比从32.64%提高至39.21%,清除O2-IC50由1.29mg.mL-1降至0.66mg.mL-1。
为了充分了解WGPHs作为抗氧化功能因子的潜力,采用8种体外抗氧化模型和不同剂量WGPHs灌胃小鼠试验对WGPHs的体内外抗氧化活性进行了研究。实验结果表明:WGPHs是良好的电子供体和氢供体;能明显抑制亚油酸体系的过氧化作用;能有效地抑制细胞膜的氧化损伤,使小鼠红细胞溶血率降低;具有清除O2-、·OH、DPPH·及活性氧H2O2的能力,其清除自由基的机制可能是通过肽类对过渡金属离子的螯合来实现的;当WGPHs的浓度为GSH的3~5倍时,可达到与GSH相当的抗氧化效率,且有较显著的量效关系;WGPHs在显著提高小鼠血清SOD和GSH-Px活性的同时也能显著降低血清MDA含量,其作用效果随着WGPHs剂量的增加而增大。
论文利用大孔吸附树脂色谱、凝胶色谱、半制备RP-HPLC、RP-HPLC分离纯化,从WGPHs中得到一个具有较强抗氧化活性的组分WGPHs-B5-fl,运用RP-HPLC、氨基酸组成分析和二级质谱分析鉴定其氨基酸序列为Arg-Glu-Trp(REW),其清除O2-·和螯合Fe2+的IC50分别为103μmol.L-1和62μmol.L-1。采用量子化学方法对REW和GSH的化学结构进行了分子模拟,得到了优势构象和优势构象的能量,研究了分子的电荷分布、前线轨道能量等。借助量子化学计算结果解释了REW的构效关系,REW中的Glu以α-COOH与Trp的α-NH2形成肽键;REW和GSH的量子化学计算结果与抗氧化活性大小的一致性表明可以采用前线轨道能级差来表征多肽分子的生物活性大小;从自然键轨道法得到的净电荷分布推测确定了REW分子中自由基反应的活性位点及Fe2+-REW螯合物的结构。
从天然抗氧化剂抗氧化作用与抗肿瘤作用之间的密切关系得到启示,论文借助于体外细胞培养技术,通过MTT比色法测定了WGPHs对人小细胞肺癌株H446生长增殖的抑制作用,通过荧光显微镜、流式细胞术观察了凋亡细胞的形态结构及其对H446细胞诱导凋亡的效应。实验结果表明:WGPHs对体外培养的人小细胞肺癌株H446有明显的增殖抑制作用,并有一定的剂量效应和时间效应;WGPHs能诱导H446细胞凋亡;荧光显微镜可见H446细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变:流式细胞仪检测出现典型的亚二倍体凋亡峰。WGPHs在体外可显著抑制人小细胞肺癌株H446的生长增殖,其抗肿瘤机制主要是诱导肿瘤细胞凋亡,将细胞阻滞在G0/G1期,使细胞不能进入S期进行DNA合成,从而使H446细胞的体外增殖受到抑制。利用大孔吸附树脂色谱、凝胶色谱、半制备RP-HPLC分离纯化,从WGPHs中得到一个具有较强抗肿瘤活性的组分WGPHs-A2-c4,运用RP-HPLC、氨基酸组成分析和二级质谱分析鉴定其氨基酸序列为Arg-Val-Phe(RVF),其体外抑制人小细胞肺癌株H446增殖的IC50为35.15μmol.L-1。