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本研究首先通过RT-PCR和WesternBlot检测脑微血管内皮细胞株LRP-1的表达。然后通过人脐静脉内皮细胞与星形胶质细胞共培养建立的BBB体外模型以及小鼠体内实验观察脑内Aβ1-40经BBB外流转运的特点,并通过抗LRP-1抗体、LRP-1受体拮抗剂——受体相关蛋白(receptorassociatedprotein,RAP)和Aβ1-40吸附剂凝溶胶蛋白干预,进一步探讨LRP-1与脑内Aβ1-40经BBB外流转运的关系,以及外周使用凝溶胶蛋白对脑内Aβ1-40外流转运的影响,初步探讨“外周沉积”治疗策略的可行性。
第一部分血脑屏障体外模型的建立与评价
目的l建立一种相对简便而可靠的血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)体外模型。方法:将人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)与小鼠星形胶质细胞(astrocyte,As)进行共培养建立BBB体外模型。电镜技术观察该模型的形态特征,跨内皮细胞电阻抗测定观察模型的物理屏障功能,14C一蔗糖与1251.牛血清白蛋白经该模型的通透性测定观察模型的屏障功能。结果:共培养后HUVEC间出现了紧密连接,第7天跨内皮细胞电阻达(267±24)Q/em2。BBB特征酶Y一谷氨酰转肽酶含量为(12.41±1.71)U/rog蛋白,与第2代HUVEC(2.76±1.00U/mg蛋白)的差异有统计学意义(P<0.01)。共培养和单层培养HUVEC对14C_蔗糖的通透系数分别为(0.93+0.32)×10-3、(8.284-3.37)×103~rrdmin,差异有统计学意义(P<0.01)。模型对125I_牛血清白蛋白具有良好的限制通透作用。
第二部分脑内β淀粉样蛋白1-40经血脑屏障体外模型的外流转运
目的:检测脑微血管内皮细胞株上LRP-1的表达,并观察LRP-1与脑侧B淀粉样蛋白1-40经BBB体外模型外流转运的关系。方法:RT-PCR和WesternBlot法检测共培养7d的HUVEC、单独培养的第2代HUVEC、小鼠脑微血管内皮细胞株bend.3和人第3代AsLRP-1mRNA及蛋白水平的表达。分别在0min、lOmin、20min、30min、60min和120min6个时间点观察外源性AB1-40(50nmol/L)经BBB体外模型(HUVEC/As共培养)的转运,以及As侧加RAP(200nmol/L)或抗LRP-1抗体(60ug/m1)预孵和HUVEC侧加入凝溶胶蛋白(9ug/m1)对AB¨o经BBB体外模型转运的影响。ELISA法检测各组转运实验后培养液中AB1-40的浓度。结果:共培养、单独培养的第2代HUVEC和bend.3均有LRP-1mRNA的表达。单独培养的As无LRP-1mRNA的表达。共培养与单独培养的第2代HUVEC均存在LRP-1蛋白水平的表达。共培养和单独培养的As均无LRP-1蛋白水平的表达。Westernblot的结果与RT-PCR结果一致。随转运时间延长,As侧AB1-40浓度逐步降低,20min时由(200.12-+-15.01)pg/m]降低到(99.07±¨.92)pg/n~。2h后浓度为(44.92_7.40)pg/ml。RAP预处理后,各时间点As侧AB1-4n浓度与对照组的差异有显著性(P<0.05)。LRP-1预处理后,各时间点As侧AB1-.40浓度与对照组的差异有显著性(P<0.05),与RAP组的差异无显著性(P>0.05)。凝溶胶蛋白组各时间点As侧AB1-40浓度与对照组的差异有显著性(P<0.05)。AB1-40经BBB的外流转运不影响BBB的屏障功能。
第三部分LRP-1与小鼠脑内B淀粉样蛋白1-40外流转运的体内实验
目的:通过体内实验观察LRP-1与小鼠脑内AB1-40外流转运的关系。
结论
1.HUVEC与小鼠As共培养建立的BBB体外模型能较好模拟在体BBB类似的结构与屏障功能。HUVEC的原代培养相对简单,容易达到共培养对细胞纯度的要求。培养液中加入氢化可的松后,HUVEC增殖迅速,节省构建模型所需要的时间,同时加入激素也有助于BBB体外模型的生物学特性的维持。
2.通过RT-PCR和WesternBlot方法检测到脑微血管内皮细胞株上LRP-1的表达。50nmol/L外源性AB1-40经BBB体外模型外流转运的半衰期在20min左右。而此浓度与3~4月龄B淀粉样前体蛋白转基因小鼠脑内AB1-40浓度相当,由此提示,生理状态下BBB具有强大的清除脑内AB1-40的能力。抗LRP-1抗体能够抑制AB1-40的外流转运,RAP同样能抑制脑侧高浓度AB1.40的外流转运,其抑制能力与抗LRP-1抗体相当。外周使用凝溶胶蛋白促进脑侧外源性AB1-40的外流转运。
3.小鼠脑内注射抗LRP-1抗体后,脑内AB1-40负荷增加,同时出现血浆AB1-40浓度的降低,提示脑内注射抗LRP一1抗体能够抑制脑内AB1-40的外流转运。脑内注射RAP后,脑内AB1-40负荷增加,同时出现血浆AB1-40浓度的降低,提示脑内注射RAP能够抑制脑内AB1-40的外流转运,并且其抑制的程度与抗LRP-1抗体脑内注射相当。外周使用AB1-40吸附剂(凝溶胶蛋白)后,脑内AB1-40负荷降低,同时出现血浆AB1-40浓度的升高,提示腹腔注射凝溶胶蛋白能够促进脑内AB1-40的外流转运。