本研究首先通过RT-PCR和WesternBlot检测脑微血管内皮细胞株LRP-1的表达。然后通过人脐静脉内皮细胞与星形胶质细胞共培养建立的BBB体外模型以及小鼠体内实验观察脑内Aβ1-40经BBB外流转运的特点，并通过抗LRP-1抗体、LRP-1受体拮抗剂——受体相关蛋白(receptorassociatedprotein，RAP)和Aβ1-40吸附剂凝溶胶蛋白干预，进一步探讨LRP-1与脑内Aβ1-40经BBB外流转运的关系，以及外周使用凝溶胶蛋白对脑内Aβ1-40外流转运的影响，初步探讨“外周沉积”治疗策略的可行性。 第一部分血脑屏障体外模型的建立与评价 目的l建立一种相对简便而可靠的血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)体外模型。方法：将人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)与小鼠星形胶质细胞(astrocyte，As)进行共培养建立BBB体外模型。电镜技术观察该模型的形态特征，跨内皮细胞电阻抗测定观察模型的物理屏障功能，14C一蔗糖与1251．牛血清白蛋白经该模型的通透性测定观察模型的屏障功能。结果：共培养后HUVEC间出现了紧密连接，第7天跨内皮细胞电阻达(267±24)Q／em2。BBB特征酶Y一谷氨酰转肽酶含量为(12．41±1．71)U／rog蛋白，与第2代HUVEC(2．76±1．00U／mg蛋白)的差异有统计学意义(P<0．01)。共培养和单层培养HUVEC对14C_蔗糖的通透系数分别为(0．93+0．32)×10-3、(8．284-3．37)×103~rrdmin，差异有统计学意义(P<0．01)。模型对125I_牛血清白蛋白具有良好的限制通透作用。 第二部分脑内β淀粉样蛋白1-40经血脑屏障体外模型的外流转运 目的：检测脑微血管内皮细胞株上LRP-1的表达，并观察LRP-1与脑侧B淀粉样蛋白1-40经BBB体外模型外流转运的关系。方法：RT-PCR和WesternBlot法检测共培养7d的HUVEC、单独培养的第2代HUVEC、小鼠脑微血管内皮细胞株bend．3和人第3代AsLRP-1mRNA及蛋白水平的表达。分别在0min、lOmin、20min、30min、60min和120min6个时间点观察外源性AB1-40(50nmol／L)经BBB体外模型(HUVEC／As共培养)的转运，以及As侧加RAP(200nmol／L)或抗LRP-1抗体(60ug／m1)预孵和HUVEC侧加入凝溶胶蛋白(9ug/m1)对AB¨o经BBB体外模型转运的影响。ELISA法检测各组转运实验后培养液中AB1-40的浓度。结果：共培养、单独培养的第2代HUVEC和bend．3均有LRP-1mRNA的表达。单独培养的As无LRP-1mRNA的表达。共培养与单独培养的第2代HUVEC均存在LRP-1蛋白水平的表达。共培养和单独培养的As均无LRP-1蛋白水平的表达。Westernblot的结果与RT-PCR结果一致。随转运时间延长，As侧AB1-40浓度逐步降低，20min时由(200．12-+-15．01)pg／m]降低到(99．07±¨．92)pg／n~。2h后浓度为(44．92_7．40)pg／ml。RAP预处理后，各时间点As侧AB1-4n浓度与对照组的差异有显著性(P<0．05)。LRP-1预处理后，各时间点As侧AB1-．40浓度与对照组的差异有显著性(P<0．05)，与RAP组的差异无显著性(P>0．05)。凝溶胶蛋白组各时间点As侧AB1-40浓度与对照组的差异有显著性(P<0．05)。AB1-40经BBB的外流转运不影响BBB的屏障功能。 第三部分LRP-1与小鼠脑内B淀粉样蛋白1-40外流转运的体内实验 目的：通过体内实验观察LRP-1与小鼠脑内AB1-40外流转运的关系。 结论 1．HUVEC与小鼠As共培养建立的BBB体外模型能较好模拟在体BBB类似的结构与屏障功能。HUVEC的原代培养相对简单，容易达到共培养对细胞纯度的要求。培养液中加入氢化可的松后，HUVEC增殖迅速，节省构建模型所需要的时间，同时加入激素也有助于BBB体外模型的生物学特性的维持。 2．通过RT-PCR和WesternBlot方法检测到脑微血管内皮细胞株上LRP-1的表达。50nmol／L外源性AB1-40经BBB体外模型外流转运的半衰期在20min左右。而此浓度与3～4月龄B淀粉样前体蛋白转基因小鼠脑内AB1-40浓度相当，由此提示，生理状态下BBB具有强大的清除脑内AB1-40的能力。抗LRP-1抗体能够抑制AB1-40的外流转运，RAP同样能抑制脑侧高浓度AB1．40的外流转运，其抑制能力与抗LRP-1抗体相当。外周使用凝溶胶蛋白促进脑侧外源性AB1-40的外流转运。 3．小鼠脑内注射抗LRP-1抗体后，脑内AB1-40负荷增加，同时出现血浆AB1-40浓度的降低，提示脑内注射抗LRP一1抗体能够抑制脑内AB1-40的外流转运。脑内注射RAP后，脑内AB1-40负荷增加，同时出现血浆AB1-40浓度的降低，提示脑内注射RAP能够抑制脑内AB1-40的外流转运，并且其抑制的程度与抗LRP-1抗体脑内注射相当。外周使用AB1-40吸附剂(凝溶胶蛋白)后，脑内AB1-40负荷降低，同时出现血浆AB1-40浓度的升高，提示腹腔注射凝溶胶蛋白能够促进脑内AB1-40的外流转运。