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研究背景及目的:急性肝损伤是临床上较为常见的一种疾病,发病急、进展快、病情重是其特点,因此亟需明确诊断和治疗。它是介于恶化和康复转归的一种特殊临界状态,如果治疗及时,肝损伤很可能得以控制,并逐渐转愈;反之,则可能恶化,甚至转变为肝衰竭,严重危害健康。急性肝损伤可由多种疾病发展而来,如病毒性肝炎、药物性肝损伤、肝切除、肝移植、内毒素性肝损伤、肝缺血再灌注等。这些疾病通常会引起肝细胞血流的改变,进而造成不同程度的肝细胞缺氧,从而引起肝组织的损伤。炎症微环境对组织损伤的发生发展具有重要的作用。而基于对调控炎症微环境治疗损伤性疾病越来越受到重视。急性肝损伤的发病机制极其复杂,其病情的发生和发展和炎症微环境的改变密切相关。早期阶段,肝组织内的库普弗细胞（Kupffer细胞）和巨噬细胞被激活后释放活性氧（reactive oxygen species,ROS）和一些炎症因子,如白介素类和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）。其中TNF-α在调节急性肝损伤过程中发挥着重要的作用。TNF-α是一种具有多态性的细胞因子,能调节炎症、细胞凋亡、新陈代谢等。TNF-α的这些生物活性和其重要的调节功能,与急性肝损伤的发生发展密切相关。研究表明在急性肝损伤的发生发展过程中,TNF-α大量生成并启动和调节其它炎症因子的生成;同时TNF-α快速进入损伤的肝细胞中,诱导启动核转录因子kappa B（nuclear factor-κB,NF-κB）的信号通路的表达,共同参与肝细胞的修复过程。然而,有一些文献报导TNF-α在急性肝损伤过程中,加重损伤的恶化。它通过激活肝细胞内的一系列信号通路,最终启动凋亡程序加速肝细胞的死亡。另外有文献报导临床上患者血清中TNF-α升高与病情恶化的程度呈正相关性。尽管目前对TNF-α的研究有着比较深入的了解,但是对于TNF-α在急性肝损伤的具体作用尚不明确。基于上述研究背景,我们实验对此进行了深入研究。首先制备了四氯化氮（Carbon tetrachloride,CCl4）皮下注射诱导大鼠急性肝损伤模型;并应用不同剂量的TNF-α抑制剂TNFR2融合蛋白变异体（TNFR2-Fc variants,TNFR2-Fcv,是一种基因合成的可溶性蛋白,能与TNF-α结合并抑制其活性）来观察不同浓度的TNF-α对急性肝损伤的作用,并探索可能的机制。研究方法:（1）急性肝损伤模型的制备:CCl4溶解在玉米油中,配制成40%的浓度。先将TNFR2-Fcv溶液腹腔注射到不同分组的雄性SD大鼠体内。15分钟以后,再将1ml/kg的CCl4皮下注射到相应组的大鼠体内。24小时以后,大鼠全部被处死,收集血液和分离新鲜的肝组织,用于后续的实验。（2）实验分组及处理:将90只体重在200至210g之间的雄性SD大鼠,随机分为9组,平均每组10只。这些大鼠分别予以CCl4（-）+0mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4（-）+8mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4（+）+0mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4（+）+0.25mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4（+）+0.5mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4（+）+1mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4（+）+2mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4（+）+4mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4（+）+8mg/kg TNFR2-Fcv处理;同时我们采用TNF-α-/-大鼠给予1ml/kg的CCl4皮下注射并将这些处理组的大鼠放置在SPF级动物房饲养。辅以25±3°C的室温下,12小时昼夜交替光照,并配以标准的饲料和清洁的饮水。（3）血清TNF-α水平的检测:用ELISA检测分析不同剂量的TNFR2-Fcv作用于急性肝损伤大鼠后,血清中TNF-α的浓度,以明确体内不同浓度的TNF-α对急性肝损伤的作用。（4）肝损伤的检测:从血液中析出血清,在自动分析仪中检测各组血清中谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（Aspartate transaminase,AST）的水平。将肝组织石蜡包埋后制成组织切片,HE染色分析各组肝组织切片的脂肪变性程度;免疫组化技术和Tunnel试剂盒检测组织切片中Cleaved-caspase3的表达和肝细胞凋亡的水平,判断各组肝损伤的程度。（5）炎症因子水平的检测:实时定量PCR（Real time-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测急性肝损伤过程中,体内不同浓度TNF-α对炎症因子如IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ等的表达影响。（6）NF-κB信号通路及抗凋亡基因的检测:Western-Blotting检测不同浓度的TNF-α在急性肝损伤过程中NF-κB信号通路的表达包括IκBα（inhibitor of NF-kappa B-α）、p-IκBα（Phospho-IκBα）和NF-κB-p65的表达。以及RT-PCR和Western-Blotting检测相关抗凋亡基因的表达如BCL-2（B-cell leukemia lymphoma 2）、BCL-XL（B-cell lymphoma-extra large）、XIAP（X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein）,和FHC（Ferritin heavy chain）。（7）统计学分析:数据结果采用统计软件SPSS 20.0进行统计分析,各组之间的均数标准误采用方差分析（Analysis of Variance,ANOVA）进行检验分析,以P<0.05为差异有统计学意义,两组之间的差别采用Student-T检验,P<0.05有统计学差异。研究结果:（1）在CCl4诱导的大鼠急性肝损伤模型中,血清TNF-α的浓度随着TNF-α抑制剂TNFR2-Fcv剂量的增加而逐渐下降,呈明显的相关性。（2）在CCl4诱导的大鼠急性肝损伤模型中,血清ALT和AST明显上升,即ALT:从36.75±8.73 U/L上升至193.27±14.26 U/L;AST:从150.86±12.34 U/L上升至253.79±12.90 U/L,p<0.01。HE染色发现肝组织中有大量的脂肪变性,同时免疫组化染色Cleaved-caspase3阳性的细胞数量明显增多、Tunnel凋亡试剂染色发现凋亡的肝细胞数目增多和Western-Blotting检测凋亡抗体表达增强。（3）在正常大鼠中,无论TNF-α抑制剂TNFR2-Fcv剂量如何改变,血清ALT和AST水平基本不变,基本处于正常范围之内。而在CCl4诱导大鼠的急性肝损伤模型中,随着TNFR2-Fcv的剂量从0mg/kg逐渐递加到8mg/kg时,体内TNF-α水平逐渐下降,血清ALT和AST水平的变化呈明显的“V”字型改变,即TNFR2-Fcv从0mg/kg增加至1mg/kg时,血清ALT和AST的值逐渐下降（P<0.01）;HE染色发现肝细胞脂肪变性的程度减轻;免疫组化和Tunnel检测到凋亡的肝细胞数目明显减少（P<0.05）。然而,随着TNFR2-Fcv的剂量进一步加大,从1mg/kg增加至8mg/kg时,TNF-α的浓度继续降低（至8mg/kg时,TNF-α接近于0pg/ml）,血清ALT和AST的值反而逐渐上升,甚至在8mg/kg时,ALT和AST水平较0mg/kg时要高（P<0.05）;HE染色发现肝细胞脂肪变性的程度反而加重;免疫组化和Tunnel检测到凋亡的肝细胞数目也大幅度增多（P<0.05）。（4）在TNF-α-/-的大鼠中,CCl4诱导急性肝损伤时,血清ALT和AST水平较野生型正常大鼠的明显升高（P<0.01）;HE染色观察到单视野肝脂肪变性十分严重。（5）RT-PCR的结果提示在急性肝损伤过程中,随着TNFR2-Fcv剂量的增加,TNF-α浓度逐渐下降,促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ水平逐渐下降,而抑炎因子IL-4的水平反而逐渐上升。（6）Western-Blotting和RT-PCR实验结果表明在急性肝损伤过程中随着TNF-α浓度逐渐下降,NF-κB信号通路基因p-IκBα和NF-κB-p65的表达以及抗凋亡基因包括Bcl-XL、FHC、XIAP和Bcl-2的表达也逐渐下降。结论:（1）TNF-α在调节急性肝损伤过程中发挥着重要的作用,适当地降低体内TNF-α浓度可有效地缓解肝损伤,然而,过度地降低TNF-α浓度反而会加重肝损伤。（2）TNF-α的损害和保护的双重作用始终贯穿在急性肝损伤的发生和发展过程。其浓度与主要发挥的效应密切相关。