分离培养原代细胞费时费力,花费高,且传代次数有限,细胞生理功能容易变异,造成不同试验结果间因细胞培养代次不一而难以比较,从而限制其进一步研究。研究表明:永生化细胞系具有许多原代细胞所没有的优点,如细胞的均一性、稳定性及操作简便等特性,为了克服山羊子宫内膜基质细胞(Endometrial Stromal Cells, ESCs)在体外培养时的缺点,为研究子宫局部免疫等功能提供大量均一的种子细胞,本试验进行了山羊子宫内膜基质细胞分离培养及永生化的研究。获得以下结果:1.采用胶原酶Ⅱ消化-低速离心-自然沉降的方法分离山羊子宫内膜基质细胞,于37℃,5 % CO2条件下培养。对培养细胞生长特性进行检测及细胞表面标志物进行免疫细胞化学检测。结果表明:分离得到的ESCs纯度可达95 %以上。以1×106个/mL密度接种培养,24 h后细胞贴壁,5 d左右可铺满皿底,细胞呈梭形和三角形,汇合呈漩涡状生长。培养的细胞呈单层贴壁生长,有接触抑制性。波形蛋白检测阳性,角蛋白检测阴性,证明分离得到的细胞为ESCs。2.经浓度梯度筛选确定转染用G418最佳浓度为600μg/mL。利用提取纯化的pCI-neo-hTERT基因的真核表达质粒转染培养二代的山羊ESCs。经G418筛选共获得5个细胞克隆,分别命名为A5、B5、B6、C4、C6。克隆A5、B5、C6来源的细胞在体外长期连续培养下,生长良好,其中A5至今已传至50代。3.免疫细胞化学检测端粒酶催化亚单位显示阳性,说明外源性hTERT稳定转染入山羊ESCs中。利用PCR-ELISA技术,对转染后第20代、第50代细胞中的端粒酶活性进行了检测,结果在转染hTERT的细胞中均检测到较强的端粒酶活性,而原代培养的细胞没有检测到。表明外源性hTERT基因可以激活山羊ESCs的端粒酶活性。4.通过对ESCs的重要表面标志物进行免疫细胞化学检测和培养细胞的形态学观察,结果表明转染后细胞具有原代细胞的表型特性。通过绘制转染细胞生长曲线和培养观察,表明转染细胞仍具有正常的细胞增殖周期和接触抑制性。转染后ESCs和未转染ESCs软琼脂内培养均不形成克隆。证明:转染的ESCs基本为正常细胞,无转化特征,保持了原代山羊子宫内膜基质细胞的生物学特性。5.用MTT法检测不同浓度不同组合的雌激素(E2)和孕激素(P4)对转染后ESCs的增殖作用的影响。结果表明:E2/P4为100/0 nmol/L和100/10 nmol/L时对转染后细胞增殖作用较明显。本试验在成功分离培养山羊ESCs基础上,将hTERT导入其中,延长了细胞在体外培养的寿命,同时保持了正常细胞的生物学特性,为在体外研究子宫内膜生理及功能奠定了基础。