论文部分内容阅读
正常细胞可以利用葡萄糖和酮体提供能量,多数恶性肿瘤细胞由于线粒体缺乏利用酮体供能的一种或多种关键酶,主要依赖葡萄糖而不能利用酮体供能,因此酮体可能对于癌细胞增殖具有重要的抑制作用。生酮是指高脂肪。脂肪分解产生脂肪酸,脂肪酸在肝内分解氧化时特有的中间代谢物是酮体,包括乙酰乙酸、β-羟基丁酸和丙酮。其中,酮体中β-羟基丁酸的含量约为78%。生酮饮食是一种由高比例脂肪、适量蛋白质、低碳水化合物以及其他营养素组成的饮食。生酮饮食实际上是酮体在细胞、分子水平上起的作用,关于生酮饮食的研究主要在小鼠等个体水平,而关于酮体对癌细胞影响的研究则更少。本文研究酮体对HeLa细胞生长与凋亡的影响,探讨酮体诱导HeLa细胞凋亡的作用机制,为临床上酮体用于癌症治疗提供理论依据。实验方法与结果培养HeLa细胞,以25 mmol/L葡萄糖(高糖DMEM完全培养基糖浓度)的培养基作为对照组,以不同糖浓度条件下添加酮体的培养基作为实验组。1在25mmol/L 葡萄糖的培养基中,添加1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、7mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、50 mmol/L 的酮体(DL-3-羟基丁酸钠),分别处理HeLa细胞48 h,MTT法检测细胞活力。结果显示,细胞增殖抑制率分别为21.0%、24.6%、33.1%、30.7%、33.5%、44.1%、46.8%、69.9%与 79.5%。选择 25 mmol/L酮体进行后续实验。2.建立HeLa细胞与脐带正常细胞共培养方法。为了更好的模拟人体内环境,有效的研究酮体对肿瘤细胞与正常细胞的影响。将HeLa细胞接种于正方形玻片上,人脐带正常细胞接种于圆形玻片上,贴壁后在PBS中充分漂洗,除去未贴壁的细胞,把HeLa细胞玻片和人脐带正常细胞玻片置于同一培养皿中进行共培养,研究药物在同一环境条件下对不同细胞的影响。与其他直接接触共培养或Transwell培养小室(上下两室分别接种细胞)相比具有成本低,操作便捷,便于研究单个细胞生理状态及活性的优势。3.HeLa细胞与人脐带正常细胞共培养于5 mmol/L葡萄糖0 mmol/L酮体组(G5K0组)、5mmol/L葡萄糖25mmol/L酮体组(G5K25组)、25mmol/L葡萄糖0mmol/L酮体组(G25K0组)、25mmol/L葡萄糖25mmol/L酮体组(G25K25组)培养基中,倒置显微镜观察细胞生长状态,结果表明72 h时,G5K0组少数人脐带正常细胞收缩变圆,处于早期凋亡状态,而HeLa细胞密度显著减小,呈晚期凋亡状态;G5K25组、G25K25组人脐带正常细胞状态良好,而G25K25组HeLa细胞密度明显减小,细胞贴壁性变差,少数细胞收缩变圆。AO/EB双重荧光染色检测细胞凋亡与坏死,结果表明,72 h时,G5K0组人脐带正常细胞少数处于凋亡状态,而HeLa细胞多数已凋亡;G5K25组人脐带正常细胞仅有少数处于凋亡状态,而HeLa细胞几乎全部凋亡。4.HeLa 细胞培养于0mmol/L、1mmol/L、5mmol/L与25mmol/L 葡萄糖;0 mmol/L、1mmol/L、5mmol/L与25 mmol/L酮体的培养基中,分别处理24 h、48 h、72 h后,MTT法检测细胞活力。结果表明,在5 mmol/L葡萄糖时,酮体能够显著抑制HeLa细胞的增殖,与酮体浓度呈正相关;25 mmol/L葡萄糖时,高浓度酮体能够抑制HeLa细胞增殖。在同一酮体浓度处理下,酮体作用72 h(58.5%)后HeLa细胞存活抑制率显著高于 24 h(25.1%)、48 h(43.2%)。5.酮体处理HeLa细胞,倒置显微镜观察表明,酮体处理组细胞密度明显降低,折光性降低,立体感减弱,少数细胞皱缩变圆,细胞活力降低。AO/EB双重荧光染色结果表明,酮体处理72 h后,G25K25组少数HeLa细胞的细胞核被染成黄色,呈早期凋亡状态,细胞密度降低;G5K25组多数HeLa细胞的细胞核被染成橘黄色,出现凋亡小体,呈晚期凋亡状态。单细胞凝胶电泳检测结果表明,酮体可以使HeLa细胞核DNA受到损伤,且低浓度葡萄糖+酮体处理后,细胞核DNA的损伤程度更严重。线粒体绿色荧光探针表明,HeLa细胞线粒体活性补偿性增强。流式细胞仪检测表明,酮体可将HeLa细胞的细胞周期阻滞于G1期,抑制HeLa细胞增殖。6.HeLa细胞经酮体处理48 h,Western Blot检测表明,与对照组相比,实验组Caspase-3主带明显减少,促凋亡蛋白Bim、Bad表达量逐渐增多,CyclinE1、CyclinD1、CDK2、CDK4和cdc2蛋白表达明显降低,P27、P21蛋白表达量明显增多。结论:在共培养条件下,酮体对HeLa细胞增殖具有明显抑制作用,而对正常细胞无明显抑制作用。后续实验证明酮体能够抑制HeLa细胞增殖,且与药物浓度及处理时间呈正相关。酮体可以将HeLa细胞的细胞周期阻滞于G1期,并通过损伤核DNA诱导HeLa细胞凋亡,且酮体+低糖作用效果更明显。酮体能够补偿性增强HeLa细胞线粒体活性。酮体通过细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p27蛋白的表达上调,抑制CyclinE-CDK2复合物的活性,使细胞无法顺利通过G1/S转换期,从而抑制HeLa细胞的增殖;通过Caspase依赖性细胞凋亡途径诱导HeLa细胞凋亡。本研究为癌症的酮体治疗法(血液中低糖高酮体)提供了理论依据。