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1、chIL-2R基因的克隆与体外重组表达依据鸡白细胞介素-2受体亚基α链(chCD25)、β(chCD122)、γ(chCD132)的cDNA序列设计特异性引物,通过RT-PCR分别扩增和克隆了chCD25、chCD132 cDNA全长序列及chCD122部分cDNA序列。chCD25和chCD132 cDNA的长度分别为1027 bp和1047 bp,各自编码由211和348个氨基酸(aa)残基所组成的前体蛋白。chCD122 cDNA片段长度为660bp,编码该蛋白的部分胞外区序列。chCD25成熟蛋白由胞外区(172aa)、跨膜区(15aa)和胞浆区(4aa)三部分组成。chCD132成熟蛋白由由胞外区(210aa)、跨膜区(23aa)和胞浆区(94aa)三部分组成。基因定位分析显示,chCD25基因位于鸡染色体1,由五个外显子和四个内含子组成。chCD122基因也位于鸡染色体1,由12个外显子和11个内含子组成。chCD132基因位于鸡染色体4,由8个外显子和7个内含子组成；chCD25和chCD122在基因结构上与人和鼠的相应基因差异较大,而chCD132的则与人、鼠相似。这些结果说明,鸡白细胞介素-2受体(chIL-2R)基因具有明显的种属特异性。将编码chCD25、chCD132的胞外区序列及chCD122部分胞外区序列,分别插入pET32a或pET28a原核表达载体。经酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),在1 mM IPTG的诱导下表达4h。SDS-PAGE和Western blot鉴定的结果显示,chCD25、chCD122和chCD132蛋白被表达,它们的分子量大小分别为38KDα、30KDα、28 KDα。通过Ni柱变性纯化的方法,获得纯度较高的chCD25、chCD122和chCD132原核蛋白。2、chIL-2R单克隆抗体制备与功能验证以原核表达的chCD25、chCD122和chCD132重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分别获得了7株(4H5、6C9、6A1、5E1、1G1、6C2、1E1)能稳定分泌抗chCD25单克隆抗体(mAbs)的细胞、4株(1G11,5A5,5B12,2C11)稳定分泌抗chCD122单克隆抗体的细胞、6株(1A1、1G11、1B9、3G11、F8、C10)稳定分泌抗chCD132单克隆抗体的细胞。Western blot检测结果显示,所有抗体细胞分泌的细胞上清均能与相应的重组蛋白发生反应。chIL-2R基因转染真核细胞的免疫细胞化学或荧光检测证实,除chCD122的mAb 5B12和chCD132的mAb 1A1外,所有mAb均能真核细胞表达的chIL-2R蛋白反应。用Con A诱导的体外淋巴细胞增殖试验证实,制备的chCD25 mAbs (5E1和6C9)、chCD122mAbs(5A5、1G11、2C11)及chCD132mAb(C10)能结合淋巴细胞表面的蛋白分子。体外淋巴细胞增殖抑制试验的研究表明,chCD25 mAb 6C9能有效地抑制鸡白细胞介素-2 (chIL-2)激活T淋巴细胞的增殖作用,并呈浓度依赖性。此提示,本文获得的chCD25基因是特异性针对chIL-2的。3、IBDV感染条件下的chIL-2R调节功能分析以IBDV感染鸡胚成纤维细胞,感染后不同时间点,在mRNA和蛋白水平分析chIL-2R及chCD132关联细胞因子的变化。结果显示,IBDV感染能激活CEF中chCD25、chCD122、chIL-2、鸡白细胞介素-4(chIL-4)、鸡白细胞介素-7(chIL-7)、鸡白细胞介素-9(chIL-9)、鸡白细胞介素-15(chIL-15)的mRNA转录显著上调,但CD132的mRNA转录处于抑制状态。与mRNA检测相对应,在IBDV体外感染48小时的CEF可检测到chCD25和chCD122蛋白的表达,不能检测到chCD132蛋白的表达。以致病性IBDV感染SPF鸡,在mRNA和蛋白水平分析chIL-2R及chCD132关联细胞因子的变化,结果显示：胸腺组织中chCD25、chCD122、chCD132、chIL-2、chIL-4、chIL-7、chIL-9、chIL-15的mRNA转录被显著抑制；与胸腺组织相反,法氏囊和脾脏组织中chCD25、chCD122的mRNA转录显著上调,chCD132的mRNA转录上调维持在较低水平,以法氏囊最不明显。与mRNA检测相对应,在IBDV感染的法氏囊及脾脏淋巴细胞表面可检测到chCD25和chCD122的表达,不能检测到chCD132蛋白的表达。这些数据显示,IBDV体内感染显著抑制了胸腺细胞chCD25、chCD122和chCD132亚基的表达,明显激活了法氏囊细胞chCD25和chCD122亚基的表达,但法氏囊细胞chCD132的mRNA基本没有明显变化。因此,我们可以确信,IBDV感染过程中chIL-2R对细胞免疫中枢和体液免疫中枢的调控机制是不同的。在非免疫组织中,IBDV感染后,脑、十二指肠、空肠组织中的chCD25. chCD122、chCD132在感染后表达下调；腺胃、盲肠、肾、肺及胰组织组织中的chCD25、chCD122、chCD132在感染后表达逐渐上调；肌胃组织中的chCD25、chCD122、chCD132处于初期的下调、中期上调和末期下调；肝组织中chCD122和chCD132在感染后表达上调,而chCD25处于初期上调,中末期下调；心组织中chCD132在感染后表达上调,而chCD25处于初期上调、中期下调和末期上调,chCD122处于初期下调,中末期上调。与chIL-2R关联的chIL-4 mRNA转录在脑抑制、在肾上调,chIL-7 mRNA转录在肌胃上调、在腺胃抑制,chIL-2、chIL-7、chIL-9 mRNAs的转录在十二指肠抑制、在盲肠上调,chIL-15mRNA转录在十二指肠上调、在空、盲肠抑制。chIL-2、chIL-7、chIL-9、chIL-15 mRNAs的转录在空肠抑制和在盲肠、心脏上调。这些结果证明,IBDV感染后chIL-2R在不同的非免疫组织的调控机制也是不同的。4、H5N1感染条件下的chIL-2R调节功能分析以H5N1感染CEF,感染后不同时间点,在mRNA和蛋白水平chIL-2R及chCD132关联细胞因子的变化。结果表明,H5N1病毒感染CEF后,能引起细胞内chIL-2R和chCD132细胞因子mRNAs表达上调。IL-2R蛋白水平的间接免疫荧光可检测到chCD25、chCD122和chCD132的表达。此结果显示,IBDV和H5N1感染过程中对chCD132调控是不同的。以H5N1感染SPF鸡,感染后不同时间在mRNA和蛋白水平分析chIL-2R及chCD132关联细胞因子的变化,结果表明,脾脏组织中chCD25、chCD122、chCD132的mRNA明显上调,法氏囊组织中仅出现chCD25和chCD132的mRNA上调,与此相反,胸腺组织中的chCD25、chCD122和chCD132的mRNA均显著下调。免疫组织化学检测也证实,脾脏组织中的chCD25+、chCD122+和chCD132+细胞的数量多于法氏囊组织,胸腺组织中不能检测到chCD25、chCD122+和chCD132+细胞。与之相对应的配体chIL-2、chIL-4在脾脏和胸腺中也出现了显著上调,在法氏囊中出现下调,说明H5N1病毒感染不仅导致了胸腺中chIL-2R+细胞从免疫中枢-胸腺向外周免疫器官的移动,同时启动了机体的TH1和TH2细胞免疫应答。就与chCD132相关联的其他细胞因子而言,chIL-15的mRNA在脾脏、胸腺、法氏囊组织中转录无不明显变化,说明chIL-15未能在机体抵抗H5N1的感染过程中发挥作用。chIL-7的mRNA在脾和法氏囊组织上明显上调,在胸腺中变化不明显,说明H5N1感染过程中chIL-7在维持外周T细胞的自我平衡过程发挥了重要作用。综合上述,H5N1病毒感染引起了免疫中枢chCD25、chCD122和chCD132分子的表达下调,外周免疫组织的上调,导致了chIL-15对chIL-2和chIL-4的调控能力破坏。