目的:肺癌是世界范围内的恶性肿瘤之一,而小细胞肺癌又是肺癌中恶性程度最高的一种。小细胞肺癌作为一种高侵袭性肿瘤,疾病进展快,易早期发生转移,虽然对放化疗敏感,但易复发和产生耐药性,患者治愈率低;且由于起源不明、复杂的肿瘤异质性、发病机制和驱动基因尚不明确等原因,小细胞肺癌的基础和临床研究发展缓慢,虽然在靶向治疗领域、分子发病机制和全基因组测序等方面进行了探索性研究,但近三十年来几乎没有什么突破性进展,被认为是“难治性肿瘤”,因此迫切需要新的研究视角和治疗方法。现今抗肿瘤免疫治疗,尤其是免疫检查点阻断剂,在黑色素瘤、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的治疗中取得了突破性进展。但是免疫检查点及相应阻断剂在小细胞肺癌中的研究情况却知之甚少。本课题从影响小细胞肺癌患者生存时间的免疫检查点入手,着力于寻找免疫检查点的表达与炎症因子IFN-γ之间的关系并探讨了相关机制,还考察了anti-CD155对CD8+T淋巴细胞功能的影响。故而,此项工作能帮助理解小细胞肺癌中免疫检查点的高表达机制,并为抗肿瘤免疫治疗提供新的策略。研究方法:1.PD-1,PD-L1,CD155,TIGIT和Galectin-9在SCLC患者中的生存分析。本研究选取了48名小细胞肺癌患者并统计他们各自的总生存时间和各项临床指标,通过免疫组化的方法确定各免疫检查点PD-1,PD-L1,CD155,TIGIT和Galectin-9在癌组织中的表达水平,再经Kaplan-Meier方法分析各免疫检查点的表达情况与患者生存时间之间的关系。并通过荧光双染的方法检测CD8+T淋巴细胞上是否存在PD-1和TIGIT表达。2.IFN-γ对小细胞肺癌细胞株中免疫检查点及信号通路表达的影响本研究选取了人小细胞肺癌细胞株NCI-H446和NCI-H1668,经不同浓度的IFN-γ和LPS刺激下,分别通过qRT-PCR,Western Blot,免疫组化等手段分析免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9的表达情况。再经qRT-PCR和Western Blot的检测手段分析了在不同浓度的IFN-γ和LPS刺激下,MAPK信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-AKT-mTOR及TLR-4/MyD88/TRAF-6的表达情况。最后分别转染MyD88的cDNA和ShRNA以上调/下调MyD88,通过Western Blot的方法分析空白对照组、LPS单独刺激组、IFN-γ单独刺激组、单独上调MyD88组、单独下调MyD88组及在LPS或IFN-γ刺激下下调MyD88组中,免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9的表达情况。3.在小细胞肺癌组织中炎症因子IFN-γ、CD8+T淋巴细胞与免疫检查点之间的相关性分析我们通过免疫组化的手段分析并确定了48名小细胞肺癌患者肿瘤组织中,炎症因子IFN-γ和CD8的表达情况;再经Pearson相关性分析的统计学方法分析了IFN-γ与免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9之间的关系以及IFN-γ和肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞数量之间的关系。最后通过Kaplan-Meier的方法分析了IFN-γ的表达与小细胞肺癌患者生存时间之间的关系。4.阻断CD155和/或PD-L1,对CD8+T淋巴细胞免疫功能的影响我们将小细胞肺癌细胞与CD8+T淋巴细胞共培养,在该共培养体系中,我们通过添加阻断性单抗分别单独阻断PD-L1,CD155及联合阻断PD-L1和CD155。通过流式仪分别分析,CD8+T淋巴细胞上荧光标记的CFSE的荧光强度,和肿瘤细胞的凋亡情况以判断不同组别中CD8+T淋巴细胞的增殖能力和细胞毒能力。结果:1.PD-L1,CD155和Galectin-9与SCLC患者的生存时间相关高表达PD-L1的小细胞肺癌患者较低表达PD-L1的小细胞肺癌患者生存时间更短(P=0.002);高表达CD155的小细胞肺癌患者较低表达CD155的小细胞肺癌患者生存时间更短(P=0.003);高表达Galectin-9的小细胞肺癌患者较低表达Galectin-9的小细胞肺癌患者生存时间更短((P<0.001))。同时高表达PD-L1和CD155的小细胞肺癌患者,生存时间较仅表达其中一者的生存时间短;而同时低表达PD-L1和CD155的小细胞肺癌患者生存时间最长(P<0.001)。而PD-1与TIGIT的表达情况与小细胞肺癌患者的生存时间无关。2.PD-1和TIGIT均表达在CD8+T淋巴细胞表面在小细胞肺癌组织中的肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞上,的确存在PD-L1和CD155的配体:PD-1和TIGIT的表达。3.IFN-γ可以诱导小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9在不同浓度的IFN-γ刺激下,我们发现小细胞肺癌细胞上免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9随IFN-γ浓度增加而表达上调;但当IFN-γ浓度过高时,免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9反而随IFN-γ浓度增加而表达下调。且随着不同浓度的IFN-γ刺激,PD-L1和CD155可同时在小细胞肺癌细胞上高表达。4.IFN-γ诱导小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9的过程中,可以像LPS一样活化TLR-4及下游的信号通路既然IFN-γ可以诱导小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9,我们进一步分析了该过程中信号通路的变化情况。我们首先发现LPS,即TLR4受体的经典激动剂,同样可以上调免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9表达。我们进而发现在IFN-γ诱导小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9的过程中,同LPS相似,MAPK信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-AKT-mTOR及TLR-4/MyD88/TRAF-6的表达均随着浓度增加而表达上调。继而我们推断IFN-γ,同LPS一样可以通过活化TLR4及下游的MAPK信号通路、NF-κB信号通路及PI3K-AKT-mTOR等,来诱导小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9。5.MyD88是小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9过程中的关键分子进一步通过阅读文献,发现LPS活化过程中的经典分子MyD88,同样在IFN-γ的刺激过程中发挥重要作用,我们进而猜测MyD88是否是小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点过程中的关键分子。通过比较空白对照组、LPS单独刺激组、IFN-γ单独刺激组、单独上调MyD88组、单独下调MyD88组及在LPS或IFN-γ刺激下下调MyD88组中,免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9的表达情况,我们发现单独上调MyD88同样可以上调免疫检查点表达,虽然程度较IFN-γ或LPS刺激时低;而在IFN-γ或LPS刺激时下调MyD88,可以降低免疫检查点的表达。因此,我们认为MyD88是小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9的过程中的关键分子。6.炎症因子IFN-γ与免疫检查点及CD8+T淋巴细胞之间的相关性分析我们发现高浓度的IFN-γ反而与免疫检查点低表达相关,但与较多的CD8+T淋巴细胞聚集相关;同时,我们还发现高浓度的IFN-γ可以诱导更多的肿瘤细胞凋亡。因此,我们认为低浓度的IFN-γ可以通过1)上调肿瘤细胞高表达免疫检查点而逃脱免疫监视;2)诱导较少的肿瘤细胞凋亡;3)富集较少的细胞毒T淋巴细胞来减少小细胞肺患者的生存时间;而高浓度的IFN-γ可以通过1)减少肿瘤细胞上免疫检查点的表达而增强免疫识别;2)诱导更多的肿瘤细胞凋亡;3)富集更多的细胞毒T淋巴细胞来增加小细胞肺患者的生存时间;这或许是IFN-γ高表达患者的生存时间较IFN-γ低表达者生存时间长的原因之一。7.联合阻断CD155和PD-L1明显改善CD8+T淋巴细胞功能我们发现单独阻断CD155对CD8+T淋巴细胞的增殖能力和细胞毒能力并无明显改善;但联合阻断PD-L1和CD155时,CD8+T淋巴细胞的增殖能力和细胞毒能力都明显改善。结论:1.高表达PD-L1,CD155或Galectin-9的小细胞肺癌患者较低表达者生存时间短;2.PD-1和TIGIT均表达在肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞表面;3.IFN-γ可以诱导小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9;4.IFN-γ诱导小细胞肺癌细胞高表达免疫检查点PD-L1,CD155和Galectin-9的过程中,可以像LPS一样活化TLR-4及下游的MAPK信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-AKT-mTOR等;而MyD88又是这一过程中的关键分子;5.高浓度的IFN-γ或许可以通过1)减少肿瘤细胞上免疫检查点的表达而增强免疫识别,2)诱导更多的肿瘤细胞凋亡,3)富集更多的细胞毒T淋巴细胞来增加小细胞肺患者的生存时间;6.单独阻断CD155或PD-L1并不能明显改善CD8+T淋巴细胞功能;而联合阻断CD155和PD-L1时可以明显改善CD8+T淋巴细胞功能。