食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,中国是世界上食管癌发病率和病死率最高的国家,每年全世界新诊断的30万食管癌患者中1/2(16.72万)以上发生在中国。河南省,特别是河南北部的林州、安阳和辉县等地,是中国也是世界食管癌发病率和病死率最高的地区,发病率高达478/10万。由于浸润、转移是引起食管癌患者死亡的主要原因,因此对食管癌浸润、转移机制的研究已成为当前研究的热点。钙粘附蛋白家族(cadherin family)与肿瘤的侵袭和转移密切相关,其中以上皮型钙粘附蛋白(E-cadherin)和神经型钙粘附蛋白(N-cadherin)分布最广泛。已有研究表明,食管鳞状细胞癌的浸润转移与E-cadherin的低表达或不表达有关。最近研究表明,在前列腺癌、乳腺癌中N-cadherin表达增多,并且在引起肿瘤浸润转移方面有着比E-cadherin减少更为重要的作用。N-cadherin对于肿瘤上皮细胞及表达N-cadherin的血管平滑肌细胞和内皮细胞之间的粘附起着重要的作用。在肿瘤形成过程中,N-cadherin的表达有助于血管形成及上皮细胞-间质细胞的迁移,从而使肿瘤细胞更加富于侵袭性,易于转移。此外,N-cadherin还是一种凋亡抑制因子,可以通过抑制凋亡而促进肿瘤细胞的生长和存活。有关食管鳞状细胞癌中N-cadherin的表达及其与食管鳞状细胞癌浸润转移关系的研究,迄今国内外尚未见报道。鉴于上述,为深入探讨N-cadherin的表达与食管鳞状细胞癌发生、发展及浸润、转移的关系,寻求食管鳞状细胞癌的早期检测指标及抑制食管鳞状细胞癌浸润转移的有效方法,本研究首先对食管鳞状细胞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管粘膜组织中E-cadherin、N-cadherin mRNA和蛋白的表达进行检测,分析两者与食管鳞状细胞癌临床诸病理学因素的关系；然后运用逆转录病毒介导的RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)沉默N-cadherin基因在人食管鳞状细胞癌细胞系EC9706细胞中的表达,以观察N-cadherin基因表达下调对EC9706细胞增殖、细胞周期分布、凋亡及体外侵袭力等生物学行为的影响,同时检测干扰前后EC9706细胞中E-cadherin、MMP-9基因表达水平的变化；最后通过荷瘤裸鼠实验检测N-cadherin基因表达下调对EC9706细胞裸鼠体内移植瘤的生长及细胞凋亡水平的影响,同时采取免疫组织化学法和Western blots检测E-cadherin、N-cadherin和MMP-9在裸鼠体内移植瘤中的表达水平,从而为食管癌侵袭机制的研究提供新的思路,并为其临床治疗提供新的靶点。第一部分E-cadherin和N-cadherin在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床病理学意义方法1.采用免疫组织化学法检测62例食管鳞状细胞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管粘膜组织之中E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达情况。2.采用RT-PCR方法检测62例食管鳞状细胞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管粘膜组织之中E-cadherin、N-cadherin基因：mRNA的表达情况。3.统计学处理：应用SPSS13.0软件处理数据,统计学数据用均数±标准差(x±s),两样本均数比较采用独立样本t检验；两个有序变量之间的相关性检验用Spearman相关分析,两分类变量的比较用Pearson’sχ2检验；以α=0.05为检验水准。结果1.免疫组织化学法和RT-PCR联合检测结果显示：正常食管粘膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞状细胞癌组织中N-cadherin的蛋白阳性表达率及mRNA的相对表达量依次升高,分别为29.0%、61.3%、75.8%和0.154±0.019、0.461±0.024、0.663±0.016,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)；而E-cadherin的则依次降低,分别为95.2%、71.0%、40.3%和0.576±0.043、0.421±0.083、0.259±0.094,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。2. E-cadherin和N-cadherin的蛋白阳性表达率及mRNA的相对表达量与食管鳞状细胞癌的浸润深度、分化程度及淋巴结转移密切相关(P<0.05),而与患者的性别、年龄无关(P>0.05)。3. E-cadherin和N-cadherin在食管鳞状细胞癌组织中的表达呈负相关关系(γ=-0.534,P<0.05)。第二部分RNA干扰沉默N-cadherin表达对EC9706细胞体外生物学行为的影响方法1.通过逆转录病毒介导的RNA干扰技术沉默EC9706细胞中N-cadherin的表达,运用RT-PCR和Western blots检测RNA干扰效率。2.运用RT-PCR和Western blots检测RNA干扰前后EC9706细胞中E-cadherin、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平的变化。3.通过Transwell小室体外侵袭实验检测RNA干扰沉默N-cadherin表达对EC9706细胞体外侵袭力的影响。4.运用MTT法、平板克隆形成实验及流式细胞仪检测RNA干扰沉默N-cadherin表达对EC9706细胞增殖、细胞周期分布、凋亡的影响。5.统计学处理：应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差表示,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA), RT-PCR和Western blots结果应用Gene Tools进行灰度值分析,上述实验均分别重复三次。以α=0.05为检验水准。结果1.与正常对照组和空载体组相比,干扰载体组EC9706细胞中N-cadherin和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平均下调(P<0.05),而E-cadherin的mRNA和蛋白表达则无明显变化(P>0.05)。2. Transwell小室体外侵袭实验结果显示：正常对照组和空载体组的穿膜细胞数分别为123.40±8.23、126.00±10.30,2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；而干扰载体组的穿膜细胞数则为49.60±6.80,与以上2组相比,其差异具有统计学意义(P<0.05)。3.MTT法检测结果显示：虽然正常对照组和空载体组相比,EC9706细胞的生长速率没有明显差异(P>0.05),但与以上2组相比,干扰载体组细胞的生长速率明显受到抑制,其差异具有统计学意义(P<0.05)；克隆形成实验结果显示：正常对照组的克隆形成率为54.58%±5.54%,空载体组的克隆形成率为57.50%±6.25%,2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；而干扰载体组的克隆形成率为16.42%±4.86%,与以上2组相比,其差异具有统计学意义(P<0.05)。4.流式细胞仪检测结果显示：正常对照组和空载体组EC9706细胞在G0/G1期的比率分别为48.6%±1.43%和50．1%±1.36%,2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；而干扰载体组EC9706细胞在G0/G1期的比率高达76.1%±1.54%,与以上2组相比,其差异具有统计学意义(P<0.05)；正常对照组和空载体组EC9706细胞的早期凋亡率分别为5.13%±0.71%、5.93%±0.80%,2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；而干扰载体组的则为26.37%±1.10%,与以上2组相比,其差异具有统计学意义(P<0.05)。第三部分荷瘤裸鼠实验检测RNA干扰沉默N-cadherin表达对EC9706细胞裸鼠体内移植瘤生长的影响方法1.将正常对照组、空载体组和干扰载体组3组EC9706细胞通过皮下注射的方式接种于裸鼠背部肩胛区，比较各组裸鼠成瘤期、成瘤大小、瘤体终重量及终体积等情况。2.运用免疫组织化学方法和Western blots方法检测3组裸鼠移植瘤组织中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表达情况。3. TUNEL法检测3组裸鼠移植瘤组织中细胞的凋亡水平。4.统计学处理：应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差表示,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA), Western blots结果应用Gene Tools进行灰度值分析,上述实验均分别重复三次。以α=0.05为检验水准。结果1.正常对照组和空载体组裸鼠移植瘤的生长速率、成瘤大小、瘤体终重量和终体积相比较,其差异均无统计学意义(P>0.05)；而与以上2组相比,干扰载体组裸鼠移植瘤的生长速率、成瘤大小、瘤体终重量和终体积明显降低,其差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.正常对照组和空载体组相比,裸鼠移植瘤组织中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表达水平无明显变化,其差异无统计学意义(P>0.05)；而与以上2组相比,干扰载体组裸鼠移植瘤组织中N-cadherin和MMP-9的蛋白表达均下调(P<0.05),而E-cadherin的蛋白表达则无明显变化(P>0.05)。3.干扰载体组(106.81±6.47)裸鼠移植瘤组织中凋亡的阳性细胞数明显增加,与正常对照组(51.55±4.68)和空载体组(54.17±5.26)相比,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1. E-cadherin和N-cadherin的蛋白阳性表达率及mRNA的相对表达量与食管鳞状细胞癌的浸润深度、分化程度及淋巴结转移密切相关,提示E-cadherin的低表达和N-cadherin的高表达与食管鳞状细胞癌的发生、发展及浸润、转移密切相关。2. E-cadherin和N-cadherin在食管鳞状细胞癌中的表达呈负相关关系,提示在食管鳞状细胞癌发生、发展过程中可能存在着E-cadherin向N-cadherin的转化。3.RNA干扰沉默N-cadherin表达能够抑制EC9706细胞的增殖,其作用机制可能是阻滞EC9706细胞于G0/G1期并诱导其凋亡。4.RNA干扰沉默N-cadherin表达可以使EC9706细胞的体外侵袭力明显下降,其作用机制可能是通过下调MMP-9的表达,降低细胞对细胞外基质的降解能力,进而降低EC9706细胞的侵袭力。5.RNA干扰沉默N-cadherin表达可明显抑制EC9706细胞裸鼠体内移植瘤的生长,提示RNA干扰沉默N-cadherin表达具有体内抗食管鳞状细胞癌细胞生长的作用,N-cadherin可望成为抗食管鳞状细胞癌治疗的潜在分子靶点。