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第一部分血小板对肝癌细胞增殖转移作用的研究目的:原发肿瘤微环境中的血小板在肿瘤增殖、转移和血管生成等方面发挥重要作用。近年来,临床现象和实验研究表明血小板影响包括前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等在内的肿瘤发生发展,但是,血小板对肝癌的作用及其机制尚不清楚。本研究旨在阐明血小板对肝癌细胞增殖转移的作用。方法:取健康成年志愿者外周血液,制备洗涤血小板。采用血小板特异性激动剂胶原相关肽(CRP,0.8 μg/ml)激活血小板,待血小板完全活化后离心,得富含血小板释放颗粒的上清,并用新鲜培养基重悬底部沉淀,得去除释放颗粒的重悬血小板。分别采用静息血小板、CRP活化的血小板、血小板释放颗粒上清及重悬活化血小板孵育肝癌SMMC.7721和HepG2细胞,12 h和24 h后,EdU实验检测肝癌细胞增殖;并检测肝癌细胞周期和凋亡情况;细胞划痕实验检测肝癌SMMC.7721细胞迁移。选用血小板释放颗粒的上清和重悬的活化血小板分别孵育肝癌SMMC.7721细胞24h,建立裸鼠皮下荷瘤模型,检测肝癌细胞体内生长情况,免疫组化检测瘤体内Ki67和Bax、Bcl-2的表达。结果:无论孵育12 h或24 h,静息血小板和CRP激活的血小板均能显著促进肝癌SMMC.7721和HepG2细胞增殖,活化血小板的释放颗粒亦显著增加肝癌细胞生长,而孵育去除释放颗粒的重悬血小板,SMMC.7721和HepG2细胞的增殖较空白对照组无明显差异。共培养24 h后,静息血小板、CRP激活的血小板和活化血小板的释放颗粒均能显著增加肝癌细胞分布在S期和G2/M期的百分比,并抑制肝癌细胞凋亡,但活化后离心重悬的血小板沉淀不影响肝癌细胞周期分布和细胞凋亡。此外,孵育活化血小板释放颗粒上清后,SMMC.7721细胞在裸鼠体内的生长显著增加,且凋亡受到抑制,而去除释放颗粒的重悬血小板对SMMC.7721细胞体内增殖和凋亡无影响。然而,共培养12 h或24 h,无论静息血小板和CRP激活的血小板,还是活化血小板的释放颗粒亦或去除释放颗粒的重悬血小板均能促进肝癌SMMC.7721细胞体外迁移。结论:血小板能促进肝癌细胞增殖转移。血小板体内外促肝癌细胞的增殖作用主要通过其活化后释放颗粒物质,而其促肝癌迁移作用不仅通过活化后的颗粒释放物,还可能通过活化的膜表面分子受体。第二部分血小板源性TGF-β和KLF6在血小板促肝癌生长中的作用研究目的:前一部分研究发现血小板通过释放颗粒物质促进肝癌细胞增殖,但其中的分子机制尚不明确。血小板α-颗粒含有丰富的TGF-β,且为体内TGF-β的主要来源。已有报道TGF-β可通过Smad3-Sp1-KLF6相互作用调节肿瘤细胞的生长,而抑癌基因KLF6是调控肿瘤增殖和细胞周期的主要因子之一。因此,我们分别采用TGF-β受体特异性抑制剂和KLF6基因沉默慢病毒KLF6 siRNA进行研究,观察血小板源性TGF-β和KLF6在血小板促肝癌增殖中的作用。方法:肝癌SMMC.7721和HepG2细胞株分别与血小板及其释放颗粒共培养12 h和24 h后,western blot检测肝癌细胞内KLF6的表达。采用慢病毒感染建立KLF6沉默的肝癌细胞株SMMC.7721-siKLF6和HepG2-siKLF6及对应的空载体对照细胞SMMC.7721-CN和HepG2-CN,分别与血小板及其释放颗粒共培养12 h和24 h后,检测肝癌细胞增殖和细胞周期的变化。采用富含活化血小板释放颗粒的上清和去除释放颗粒的活化血小板(重悬血小板)分别孵育肝癌SMMC.7721-CN和SMMC.7721-siKLF6细胞24 h后,建立裸鼠皮下荷瘤模型,检测肝癌细胞体内生长情况,免疫组化检测瘤体内Ki67和Bax、Bcl-2的表达。预先孵育TGF-β受体特异性抑制剂SB431542后,肝癌细胞与血小板及其释放颗粒共培养12 h和24 h,免疫印迹检测肝癌细胞内KLF6的表达情况;EdU实验检测肝癌细胞增殖。结果:核转录因子KLF6表达于肝癌细胞中,在血小板内无表达。血小板及其释放颗粒明显降低肝癌细胞内KLF6的表达水平,而重悬的活化血小板对肝癌KLF6的表达无影响。慢病毒转染肝癌细胞后,KLF6基因沉默的细胞株SMMC.7721-siKLF6和HepG2-siKLF6细胞体内外增殖水平明显较空载体对照组SMMC.7721-CN和HepG2-CN细胞高。与血小板及其释放物共培养后,转染空载体的对照组肝癌细胞增殖增加,处于S期和G2/M期细胞比重增多,但重悬血小板对SMMC.7721-CN和HepG2-CN细胞增殖和细胞周期分布影响不大;然而,血小板及其释放颗粒对KLF6基因沉默的肝癌细胞增殖和细胞周期分布均无显著影响。同样,在体内实验中,血小板释放颗粒上清,而非重悬血小板,显著促进SMMC.7721-CN细胞体内增殖,并抑制细胞凋亡,但SMMC.7721-siKLF6细胞体内生长无显著变化。此外,预孵育TGF-β受体特异性抑制剂SB431542,可消除血小板及其释放颗粒诱导的肝癌细胞增殖,亦抑制了血小板及其颗粒诱导的肝癌细胞内KLF6表达降低。结论:血小板对肝癌细胞的促增殖作用主要通过其活化后释放颗粒内容物,其中α-颗粒内的TGF-β作用于肝癌细胞膜表面相应受体,抑制肝癌细胞核转录因子KLF6的表达,进而促进肝癌细胞增殖。第三部分肝癌细胞诱导血小板聚集的作用及机制探讨目的:临床现象和研究表明肝癌患者体内血小板活性升高,我们前期实验提示肝癌细胞可一定程度激活血小板,但其中的作用及分子机制尚不清楚。在此,我们初步探讨了肝癌细胞诱导血小板聚集的作用及相应的分子机制。方法:采用血小板聚集仪检测肝癌细胞SMMC.7721和HepG2体外诱导血小板聚集的作用;采用不同的抑制剂和蛋白免疫印迹分析探讨肝癌诱导血小板聚集的分子机制。结果:肝癌细胞SMMC.7721和HepG2均可明显促进血小板聚集。预孵育ADP水解酶Apyrase,不影响肝癌诱导的血小板聚集,而GP Ⅵ抗体JAQ-1和αⅡbβ3阻断剂盐酸替罗非班可完全抑制肝癌细胞诱导的血小板聚集;此外,SFKs广谱抑制剂PP2和PI3K非特异性抑制剂LY294002可部分抑制肝癌细胞诱导的血小板聚集。免疫印迹分析显示,肝癌细胞诱导血小板GP Ⅵ通路下游信号PLCγ2和整合素β3磷酸化。结论:肝癌细胞通过血小板GP Ⅵ激活相关信号SFKs/PI3K/PLCγ2,进而活化整合素信号αⅡbβ3,诱导血小板活化、聚集。