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目的:研究表明p53基因在绝大部分肿瘤中存在高突变率,这种突变与肿瘤细胞的多药耐药有着密切关系。本研究拟探讨采用磁性纳米颗粒介导wtp53基因转染人肝癌耐药细胞株HepG2/5-Fu诱导其发生凋亡及其耐药的研究。研究方法:(1)人肝癌耐药细胞株HepG2/5-Fu多药耐药性分析,检测HepG2/5-Fu细胞株对不同抗肿瘤药物的敏感性。(2)流式细胞仪分析HepG2/5-Fu细胞在5-Fu作用的凋亡情况以及对5-Fu的耐受分析。(3)RT-PCR分析HepG2/5-Fu细胞株中凋亡相关基因p53、bcl-2、bcl-xl、bax等基因的表达情况。(4)SSCP方法分析HepG2/5-Fu细胞株中p53基因的突变情况。(5)制备IONP-PLL纳米颗粒,构建氧化铁磁性纳米转运体系,分析其生物学效应。(6)以IONP-PLL纳米颗粒为基因转运载体,将wtp53基因转入HepG2/5-Fu耐药性细胞株,观察5-Fu对转染有wtp53基因的HepG2/5-Fu细胞的杀伤效应。结果:(1)HepG2/5-Fu细胞与HepG2细胞相比除对5-Fu耐药外,对其它几种常用化疗药均有不同程度的耐药性,其中对5-氟尿嘧啶耐药倍数达107.0倍,对紫杉醇的耐药倍数达49.0倍。(2)HepG2细胞中未经5-Fu处理的对照组、30μmol/L 5-Fu组及150μmol/L 5-Fu组的凋亡指数分别为(6.5±1.0)%、(14.0±4.0)%和(20.0±5.0)%;30μmol/L 5-Fu组和150μmol/L5-Fu组与对照组相比,凋亡分别增加了1.2倍和2.1倍,差异具有显著性(P<0.05)。而经同样浓度5-Fu处理的HepG2/5-Fu细胞中对照组、30μmol/L 5-Fu组及150μmol/L 5-Fu组的凋亡指数分别为(6.7±0.7)%、(7.1±2.2)%和(6.5±2.0)%:30μmol/L5-Fu组150μmol/L 5-Fu组与其对照组相比,细胞凋亡变化不明显。(3)经30μmol/L和150μmol/L 5-Fu处理后,HepG2细胞与其对照组相比,呈现明显的G0/G1期增加,S期、G2/M减少,而HepG2/5-Fu细胞与其对照组相比细胞周期未见改变。(4)PCR分析发现与HepG2细胞相比,HepG2/5-Fu细胞耐药株bcl-xl、bcl-xs和bax的表达增高,而p53和cpp32的表达减少,特别是p53基因,表达明显减少。在人肝癌细胞HepG2和HepG2/5-Fu细胞mRNA水平均没有检测到bcl-2的表达。(5)应用碱沉淀法制成的氧化铁纳米颗粒经葡聚糖修饰后形成的DCIONP-PLL纳米颗粒粒径小,直径47±15nm,分布均匀,悬浮性好。在酸性的条件下,IONP具有结合DNA的能力,但是在中性和碱性的条件下,DNA结合能力差。在IONP和DNA的质量比为1∶1时,pH=3时,IONP和DNA结合力强。IONP与DNA的质量比为2:1时,结合率达98%。在酸性的条件下,氧化铁纳米颗粒可保护DNA不被降解。(6)在中性环境下,IONP-PLL有很强的DNA结合力,且随着IONP-PLL和DNA质量比的增加,IONP-PLL的DNA结合力不断增强。IONP-PLL能保护DNA抵御核酸酶的降解。IONP-PLL和IONP-PLL/DNA复合物对于细胞几乎没有毒性,,但随着IONP-PLL的增加,对细胞的毒性略有增加。(7)转染wtp53基因的HepG2/5-Fu细胞对5-Fu呈剂量依赖性杀伤效应和时间依赖性杀伤效应,在5-Fu作用下,能发生明显的凋亡效应。结论:(1)wtp53基因的突变与肝癌细胞的细胞周期的改变、耐药性的产生相关,是肝癌细胞HepG2/5-Fu产生多药耐药性的机制之一。(2)在氧化铁纳米颗粒表面修饰多聚赖氨酸,使氧化铁纳米颗粒表面能可逆结合生物治疗用的核酸分子,该纳米颗粒能作为高效的基因转运载体,且毒性小,安全可靠。(3)以wtp53基因为靶点的肝癌基因治疗有望成为治疗晚期肝癌的一种新的治疗策略。