皮肤切创愈合过程是机体保持组织完整性而产生的一个连续而复杂的过程，大致分为三个阶段，即炎症期、增生期和组织重建期，有多种细胞因子和炎症细胞参与。研究表明，皮肤损伤愈合过程中保持细胞数量的平衡是通过程序性细胞死亡(programmed cell death)，即细胞凋亡(apoptosis)这一机制完成的[1]。我们的前期研究认为caspase家族成员可能参与皮肤损伤愈合过程中多型核细胞、单核细胞、成纤维细胞这三种细胞的凋亡，并且caspase家族成员有望成为用于皮肤损伤时间推断的指标[4-5]。而且在皮肤切创愈合过程中caspase的表达、激活情况对参与损伤愈合中细胞凋亡的影响和对组织愈合的影响尚未见报道，也未见关于在体研究参与皮肤损伤愈合过程中细胞凋亡机制的研究报道。Q-VD-OPH(Quinolyl-Valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorophenoxyl]-rr,ethyl ketone)是一种优于Z-VAD-fmk和Boc-D-fmk的广谱抑制剂。本实验在切创的动物模型体内应用caspase广谱抑制剂O-VD—OPH，抑制caspase级联的激活，从而抑制caspase活性，并且应用免疫组织化学染色技术、比色法、Western blotting和RT-PCR技术等方法检测各组小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-3，-6，-7蛋白的表达、激活情况和mRNA的表达情况，从而阐述皮肤损伤愈合过程中细胞凋亡的机制和凋亡细胞的信号转导途径。实验材料和方法1．健康成年清洁级昆明系小鼠162只，体质量30±2g，随机分为3组：实验组(Q-VD-OPH组)、对照1组(DMSO组)、对照2组(NaCI组)。每组小鼠又分成0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d时间段，每时间段6只小鼠。实验切口前30min小鼠腹腔注射相应液体，乙醚气体吸入麻醉，背部剪毛处理，常规手术消毒，在背部中央做一纵行长1.5cm皮肤全层切口，深达筋膜。每24h重复给药一次。分别于伤后不同时间将小鼠脱颈椎处死，取伤口处1.0cm×1.5cm皮肤组织。部分固定后石蜡包埋，5μm厚度连续切片。部分所取皮肤组织用冷生理盐水清洗后置于液氮内速冻，-70℃保存备用于蛋白印迹分析和活性测定分析，部分用1‰DEPC水冲洗后用Trizol提取mRNA，用于RT-PCR分析。2．常规H．E染色。3．免疫组织化学染色(SP法)：4．Western blotting分析；5．Caspase-3，-6活性测定；6．RT-PCR；7．图像分析与统计学处理应用OLYMPUS BX 51显微照相摄像系统(日本)、计算机显微图像分析系统(Meta Morph／DDIO／BX51)，×400倍下，在损伤区及损伤周边区随机选10个视野，计数包括多型核细胞、单核细胞、成纤维细胞在内的细胞总数和阳性细胞数。计算阳性细胞百分率，在SPSSll.O for windows软件进行统计学方差分析。Western blotting和RT-PCR分析结果应用Fluochem V2.0软件(美国阿尔法公司，电泳凝胶图像工作站)分析，作灰度扫描分析测定扩增条带灰度值，用内参照β-actin修正比较各组表达水平的差异。结果采用方差分析。实验结果第一部分：小鼠皮肤切创愈合过程中应用caspase抑制剂后皮肤损伤愈合过程的病理形态学变化Q-VD-OPH实验组愈合过程较对照组快。Q-VD-OPH组伤后6h出现多型核细胞浸润，12h内可见大量浸润的炎细胞，1d可见多型核细胞数量减少，3d单个核细胞堆积，成纤维细胞增生。5d肉芽组织增生明显。7d可见大量的单个核细胞和长梭形细胞并可见大量的管腔样结构。伤后10d肉芽组织增生明显，14d形成增生性瘢痕。第二部分：小鼠皮肤切创愈合过程中caspase抑制剂对caspase-3，-6，-7表达影响的免疫组织化学研究对照组中caspase-3，-6，-7阳性表达主要存在于多型核细胞、单个核细胞和成纤维细胞中(细胞种类主要根据形态来区分)，并且各时间段相邻两组caspase-3，-6，-7阳性细胞率存在显著性差别(P＜0.01)，Q-VD-OPH组还可见肉芽组织内堆积的成纤维细胞大部分表达caspase-3阳性，阳性细胞率直至14d达到最高峰。而此时却很少表达caspase-6，-7。实验组阳性细胞率与对照组存在显著性差别(P＜0.01)。第三部分：小鼠皮肤切创愈合过程中caspase抑制剂对caspase-3，-6，-7表达及其剪切影响的蛋白印迹分析对照组caspase-3，-6，-7的表达存在时间规律性。Q-VD-OPH组随损伤时间延长，caspase-3前体表达逐渐增多，直至14d达高峰，但实验组未检出caspase-3的活化片段；caspase-6，-7前体表达趋势同对照组，但杂交强度明显降低，而且只在1d-7d组检出少量活化片段。与对照组存在显著性差异。第四部分：小鼠皮肤切创愈合过程中oaspase抑制剂对caspase-3，-6剪切及其活性变化的研究对照组caspase-3活性倍数增值在12h和10d分别达高峰，Q-VD-OPH组对caspase-3的活性完全抑制。对照组caspase-6活性倍数增值在3d达高峰，Q-VD-OPH部分抑制了caspase-6的活性，与对照组各时间段相比均有显著性差异。第五部分：小鼠皮肤切创愈合过程中caspase抑制剂对caspase-3，-6，7 mRNA表达水平影响的研究对各组各时间段样本进行RT-PCR实验并进行相对灰度测定分析，发现对照组caspase-3，-6，-7mRNA的表达存在时间规律性。Q-VD-OPH组随损伤时间延长，caspase-3mRNA表达逐渐增多，直至14d达高峰；caspase-6，-7mRNA表达趋势同对照组，但杂交强度明显降低。表明Q-VD-OPH可以影响caspase-3，-6，-7 mRNA的合成。讨论近年的研究表明，caspase是负责执行凋亡细胞中特异性酶切的关键蛋白酶，caspase蛋白酶家族是一类细胞凋亡调节因子家族，当受到一定的信号刺激后通过蛋白酶级联反应顺序激活，在细胞凋亡过程中起关键作用。结合近年来的研究结果，提示caspase-3，-6，-7极有可能是皮肤损伤愈合过程中诱导中性粒细胞、单核细胞、成纤维细胞凋亡的最终执行因子。为进一步阐述caspase家族成员在皮肤损伤愈合过程中执行细胞凋亡的作用，应用caspase抑制剂人为抑制其剪切和激活，观察皮肤损伤愈合过程的变化和细胞凋亡的情况。Q-VD-OPH作为新型的caspase广谱抑制剂，通过抑制上游的启动型caspase而发挥抑制细胞凋亡的作用。本实验以前期动物实验为基础，通过在体应用Q-VD-OPH研究皮肤损伤愈合过程中细胞的凋亡机制，探讨Q-VD-OPH对caspase-3，-6，-7的抑制情况和对细胞凋亡的影响。本实验的研究发现正常对照皮肤中检出caspase-3前体的表达，表明casapse-3可能参与表皮基底层角朊细胞(kerotinocyte)的凋亡，并参与皮肤稳态的维持。而且还检出caspase-6的活性裂解片断，说明caspase-6在正常皮肤中发挥维持稳态和执行皮肤新陈代谢相关的细胞凋亡的作用。一、皮肤损伤愈合过程中中性粒细胞凋亡的机制皮肤损伤愈合的早期，caspase-3、-6、-7被激活，尤其是在中性粒细胞浸润的高峰时相内caspase-3的活性最高，说明在中性粒细胞的凋亡过程中caspase-3的激活发挥主要的作用。应用Q-VD-OPH后，caspase-3的激活被抑制，但中性粒细胞仍旧不发生堆积。说明其自发性凋亡还存在非caspase-3途径，存在其他代偿性途径发挥执行细胞凋亡的作用。二、皮肤损伤愈合过程中单核细胞凋亡的机制免疫组织化学染色结果表明对照组中浸润和增生的单个核细胞中有caspase-3，-6，-7的表达，caspase-3，-6，-7的激活在单个核细胞的凋亡过程中发挥重要作用。Q-VD-OPH抑制caspase-8，-9，-12的活性，并且抑制了caspase-3，-6，-7的活化。由于在Q-VD-OPH组内，单个核细胞浸润和增生的高峰时相内caspase-3的激活完全被抑制，但可检出caspase-6，-7的活性片段，说明caspase-6，-7激活不单纯由上游因子caspase-8，-9，-12刺激激活，或者我们使用的抑制剂浓度并未完全抑制caspase家族成员的活性，而且在单核细胞的凋亡过程中caspase-6，-7可能不起主要作用。三、caspase-3，-6，-7在成纤维细胞凋亡和增生性瘢痕形成过程中的作用caspase-3的激活在晚期肉芽组织向瘢痕组织转化过程中发挥主要作用。caspase-6，-7亦参与成纤维细胞的凋亡。应用caspase抑制剂后，caspase-3激活片段完全被抑制，引起成纤维细胞大量堆积。Q-VD-OPH组内在10d和14d时间段上caspase-6，-7的激活被抑制进一步说明了caspase-6，-7的激活在成纤维细胞的凋亡和增生性瘢痕的形成过程中发挥重要的作用。四、caspase-3，-6，-7在皮肤损伤愈合时间推断上的应用皮肤损伤愈合过程中caspase-3，-6，-7的阳性细胞率、Western blotting和caspase-3，-6以及RT-PCR结果表明caspase-3，-6，-7基因和蛋白的表达水平上存在时间规律性，进一步证实了caspase-3，-6，-7在皮肤损伤时间推断上的应用价值。五、DMSO对皮肤损伤愈合的影响及对caspaso活性的影响DMSO可以较低程度地抑制caspase-3，-6，-7前体的表达和激活，其中对caspase-3的抑制作用较弱，而对CaSpase-6的抑制作用相对较强。结论1．皮肤切创愈合过程中应用Q-VD-OPH后造成皮肤的异常愈合，形成增生性瘢痕；2．皮肤切创愈合过程中，Q-VD-OPH抑制单核细胞和成纤维细胞的凋亡过程，导致该类细胞的堆积，但并未影响浸润的多型核细胞数目的减少；3．皮肤切创愈合过程中Q-VD-OPH抑制caspase-3的激活，增加了caspase-3基因与前体的表达；4．皮肤切创愈合过程中Q-VD-OPH抑制caspase-6，-7基因和前体的表达与激活；5．皮肤切创愈合过程中组织中浸润的中性粒细胞的凋亡可能与caspase-3的激活相关，当其激活被抑制时，可能出现其他代偿性途径执行细胞凋亡；6．caspase-3的激活可能是执行皮肤切创愈合过程中组织中单个核细胞、成纤维细胞凋亡的关键因子；caspase-6，-7激活不单纯由上游因子刺激激活，并且caspase-6，-7可能不是执行单核细胞和成纤维细胞凋亡的关键因子；7．DMSO可以较低程度的抑制caspase-3，-6，-7的表达和激活。其中对caspase-3的抑制作用较弱，对caspase-6的抑制作用较强。