目的：1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, SIP)是一种存在于血浆中的具有生物活性的神经鞘磷脂。S1P主要由血小板合成和分泌,其他细胞如红细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞以及内皮细胞都能够分泌S1P。SIP的浓度可通过复杂的代谢过程而被调节,其浓度的变化直接调节其生物学效应。S1P在细胞内可作为第二信使,与调节性分子如酶、通道蛋白、转录因子等相互作用而发挥效应；S1P还可以作为细胞外配体,与几乎存在于所有细胞种类的S1P膜受体结合,并通过不同的信号转导通路,影响细胞的生存、增殖、分化、迁移和形态发生等,发挥广泛的生物学效应。S1P受体为G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCR),目前至少发现有5种,分别为S1PR1、 S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5,分布于不同的细胞。内皮细胞主要表达S1PR1、 S1PR2和S1PR3,表达水平S1P1>S1P2≈S1P3。不同亚型的S1P受体结合的G蛋白不尽相同,其中S1PR1与Gi相偶联,S1PR2/3则与Gi、Gq、G12/13偶联。另外,S1PR1和S1PR2/3对S1P的亲和力也有区别,生理浓度下S1P主要与S1PR1结合；浓度较高(如超过5 μmol/L时)则与S1PR2/3结合。有研究发现,生理浓度下S1P与S1PR1结合,介导Racl依赖的内皮屏障保护作用；浓度较高时,则与S1PR2/3结合,介导RhoA依赖的内皮屏障损伤作用。其中生理浓度的S1P对内皮细胞屏障功能的保护作用被认为具有重要的临床治疗意义,有可能为感染、损伤等病理状态下的组织炎症,特别是为血管通透性的升高所导致的组织水肿提供治疗途径。因此,深入研究S1P调节内皮细胞功能的作用和机制,对于将来在治疗上发挥并加强S1P的内源性血管通透性稳定因子的作用具有重要的意义。有研究证明,S1P与受体结合后的信号转导通路和细胞内钙信号变化关系密切。内皮细胞钙离子浓度的变化主要来自两个途径,一个是由磷脂酶C(phospholipase C, PLC)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)及其受体介导的内质网的钙释放,另一个是钙池操纵的钙内流(store-operated calcium entry,SOC)离子通道。我们初步假设S1P与受体结合后的信号转导通路是：生理剂量的S1P通过S1PR1激活细胞内质网的钙释放,使细胞内钙离子浓度升高,导致Rac的激活和移位并最终引起细胞骨架蛋白聚集细胞周边,加强细胞间连接结构和屏障的完整性；过量的S1P通过S1PR2/3引起细胞外钙的内流,细胞内钙离子浓度升高,与RhoA协同,并通过RhoA下游靶效应分子ROCK的磷酸化,介导骨架蛋白的收缩,形成应力纤维,细胞间连接松懈和屏障功能损伤。本研究的主要工作是：1.探讨生理浓度S1P是否通过S1PR1引起细胞内质网的钙释放,导致Rac的激活和移位,并最终使内皮细胞屏障功能得到加强。2.高浓度S1P是否通过S1PR2引起细胞外钙内流和RhoA/ROCK信号通路的激活,介导内皮细胞功能损伤。研究将为进一步探讨细胞内的钙信号时空动力学在S1P介导的内皮细胞屏障功能调节中的作用打下基础,并为临床处理炎症等引起的血管通透性升高和组织水肿提供新的思路。方法：实验中主要的研究对象为人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)使用G-LISATMho GTPase活性检测试剂盒分别检测Racl或RhoA活性；免疫印迹技术检测ROCK磷酸化水平；用免疫细胞荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察细胞内磷酸化ROCK定位和分布以及细胞骨架蛋白形态和结构变化：使用跨细胞电阻仪检测内皮细胞单层跨膜电阻(Trans-endothelial electric resistance,TEER),以反映内皮细胞单层通透性,TEER越大,说明内皮细胞单层通透性越低,反之亦然。结果：一、S1P对内皮细胞Racl活性的影响及其机制1.不同浓度S1P对内皮细胞Rac1活性的影响S1P对内皮细胞Racl活性的影响具有时间效应和剂量依赖性。生理浓度(0.5μmol/L) SIP刺激内皮细胞2 min,引起Racl活性显著增加(P<0.05),随后逐渐增加,至20 min时,Rac1活性相对空白对照组仍有显著性差异(P<0.05)。实验还发现,与空白对照组相比,0.1μmol/L S1P刺激细胞5 min可引起Racl活性显著增加(P<0.05),0.5 μmol/L S1P刺激引起Rac1活性进一步增加(P<0.05),而1.0 μmol/L刺激引起的Rac1活性稍有下降,但仍具有统计学意义(P<0.05),但10.0 μmol/L刺激Rac1活性差异较空白对照组已无统计学意义。结果提示,只有低浓度(0.1,0.5,1.0μmol/L)S1P刺激导致Rac1活性的升高,高浓度(10.0μmol/L) SIP刺激没有这个效应。2.S1P引起内皮细胞Racl活性改变的机制(1)S1P受体(S1PRs)在S1P介导的内皮细胞Racl活性变化中的作用与0.5μmol/L SIP单独作用组相比,S1PR1拮抗剂VPC23019预处理组的Rac1活性明显降低(P<0.05),而S1PR2拮抗剂JTE013预处理细胞不能明显降低生理浓度S1P介导的的Rac1激活,与S1P单独作用组相比无统计学差异。实验中还发现S1PR1激动剂SEW2871单独作用细胞,与空白对照组相比,SEW287引起了细胞Rac1活性的显著升高(P<0.05)。结果提示,S1PR1参与介导了低浓度S1P引起的Rac1激活,而S1PR2无此作用。(2)钙离子在S1P介导的内皮细胞Rac1活性变化中的作用与0.5μmol/L S1P单独作用组相比,IP3R抑制剂2-APB预处理组和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(phosphatidylinositol-specific phospholipase C,PI-PLC)抑制剂ET-18-OCH3预处理细胞可使S1P引起的Rac1激活明显降低(P<0.05),而细胞膜钙离子通道抑制剂钉红(Ruthenium Red,RR)预处理细胞不能明显降低生理浓度S1P介导的的Rac1激活,与S1P单独作用组相比无统计学差异。结果提示,内钙释放参与介导了低浓度S1P引起的Rac1激活,而细胞外钙无此作用。(3)钙离子在S1PR1激活介导的内皮细胞Rac1活性变化中的作用用SEW2871激活S1PR1。发现与SEW2871单独作用组相比,2-APB预处理组和ET-18-OCH3预处理组的Rac1活性明显降低(P<0.05),而RR预处理细胞不能明显降低SEW2871介导的Rac1激活。结果提示,S1PR1参与介导低浓度S1P引起的Rac1激活,依赖内钙释放,而与外钙内流无关。二、S1P对内皮细胞RhoA和ROCK活性的影响及其机制1.不同浓度S1P对内皮细胞RhoA活性的影响S1P对内皮细胞RhoA活性的影响具有时间效应和剂量依赖性。给予高浓度S1P(10 μmol/L)刺激引起RhoA活性显著增加,RhoA活性在2 min分钟即到达峰值(P<0.05),随后逐渐降低,与空白对照组相比,作用5 min时活性差异仍然有统计学意义(P<0.05),作用1 0 min时RhoA活性差异已无统计学意义。实验还发现,低浓度S1P(0.1μmol/L,0.5μmol/L,1.0μmol/L)刺激内皮细胞2-5 min时,RhoA活性与空白对照组相比,差异没有统计学意义(P>0.05)。结果提示,只有高浓度S1P刺激导致RhoA活性的升高,生理浓度S1P刺激没有这个效应。2.S1P引起内皮细胞RhoA活性改变的机制(1)S1P受体(S1PRs)在S1P介导的内皮细胞RhoA活性变化中的作用与10.0μmol/L S1P单独作用组相比,S1PR2拮抗剂JTE013预处理组的RhoA活性明显降低(P<0.05),而S1PR1拮抗剂VPC23019预处理细胞不能明显降低高浓度S1P介导的的RhoA激活,与S1P单独作用组相比无统计学差异。用S1PR1激动剂SEW2871单独作用细胞,发现与空白对照组相比,SEW2871不能引起了细胞RhoA活性的显著升高。结果提示,S1PR2参与介导了高浓度S1P引起的RhoA激活,而S1PR1无此作用。(2)钙离子在S1P介导的内皮细胞RhoA活性变化中的作用与10.0 μmol/L S1P单独作用组相比,RR预处理细胞明显降低了高浓度S1P引起的RhoA激活(P<0.05),而2-APB或ET-18-OCH3预处理细胞不能明显降低高浓度S1P介导的的RhoA激活,与S1P单独作用组相比无显著统计学差异。以上结果提示,外钙内流参与介导了高浓度S1P引起的RhoA激活,而细胞内钙释放在此过程不起作用。3.S1P对内皮细胞ROCK活性的影响及机制当低浓度SIP (0.1 μmol/L,0.5μmol/L,1.0μmol/L)刺激内皮细胞时,与空白对照组相比,ROCK磷酸化水平变化的差异没有统计学意义(P>0.05)；当高浓度SIP (10 μmol/L)刺激细胞时,ROCK磷酸化的水平显著升高,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示,高浓度S1P能引起内皮细胞ROCK磷酸化水平增高。研究还通过免疫荧光染色法观察了不同浓度S1P对内皮细胞内磷酸化ROCK分布的影响。对照组中,磷酸化ROCK (p-ROCK)主要较集中地分布在核周,胞浆中分布和含量都较少。低浓度S1P(0.1μmol/L,0.5μmol/L,1.0μmol/L)刺激内皮细胞时,p-ROCK的分布较对照组相比没有明显变化。当S1P浓度达到10 μmol/L对,p-ROCK在胞浆中的着色明显增加,分布增多且分散。结果提示,高浓度S1P能引起ROCK的磷酸化激活,并且改变其在细胞中的分布同样,本研究也检测了钙离子在S1P介导的ROCK激活中的作用。实验中发现,RR预处理细胞明显降低了高浓度S1P引起的ROCK激活(P<0.05),而2-APB或ET-18-OCH3预处理细胞不能明显降低高浓度S1P介导的的ROCK激活。免疫荧光染色的结果也发现,2-APB或ET-18-OCH3预处理细胞,p-ROCK在细胞分布的变化与单纯给予高浓度SIP (10 μmol/L)处理的细胞比较没有明显变化；RR预处理细胞明显抑制了高浓度S1P介导的p-ROCK的分布变化。以上结果提示,胞外钙内流可能参与介导了高浓度S1P引起的ROCK激活和p-ROCK分布变化。三、S1P对内皮细胞骨架蛋白结构和分布的影响及其机制1.不同浓度S1P对内皮细胞骨架蛋白结构和分布的影响实验发现,相对于对照组细胞,低浓度(0.5 μmol/L) S1P组可见带状闭合蛋白ZO-1和丝状肌动蛋白F-actin呈连续光滑的环状分布在细胞周边近胞膜处,胞浆内少有分布,胞内无应力纤维形成,细胞间连接紧密,无明显空隙；高浓度(10.0μmol/L) S1P组可见ZO-1和F-actin环状结构遭到破坏,呈现断裂、破碎,边缘粗糙有毛刺样突起,分布亦不再限于细胞周边而呈现向胞浆内化,胞内出现大量肌动蛋白形成的丝状应力纤维,细胞形态失去典型铺路石样外观,细胞间出现大量空隙。结果提示,低浓度(0.5 μmol/L) S1P具有保护ZO-1和F-actin结构和分布的功能,高浓度(10.0μmol/L) S1P具有破坏ZO-1和F-actin结构和形态的功能。2.受体在S1P引起的内皮细胞骨架蛋白结构和分布变化中的作用实验发现,S1PR1拮抗剂VPC23019预处理组较0.5 μmol/L S1P或S1PR1激动剂SEW2871单独作用组,ZO-1和F-actin环状结构呈现部分断裂、破碎,边缘不光滑有毛刺样突起,胞内有少量ZO-1分布,出现少量丝状应力纤维；S1PR2拮抗剂JTE013预处理组较10.0 μmol/L S1P单独作用组,ZO-1和F-actin的结构和分布皆有一定改善,但仍未达到正常对照组细胞水平。结果提示,S1PR1介导了低浓度S1P对ZO-1和F-actin结构和分布的保护作用；S1PR2介导了高浓度S1P对ZO-1和F-actin结构和分布的破坏作用。3. Racl和ROCK在S1P引起的内皮细胞骨架蛋白结构和分布改变中的作用实验发现,Racl抑制剂NSC23766预处理组较0.5μmol/L S1P单独作用组,ZO-1和F-actin环状结构连续性呈现部分中断,边缘模糊、粗糙,胞内有少量ZO-1分布,出现少量丝状应力纤维；ROCK抑制剂H1152预处理组较10.0μmol/LS1P单独作用组,ZO-1和F-actin的结构和分布皆有一定改善,但未达到正常对照组细胞水平。结果提示,Rac1介导了低浓度S1P对ZO-1和F-actin结构和分布的保护作用；ROCK介导了高浓度S1P对ZO-1和F-actin结构和分布的破坏作用。4.钙离子在S1P引起的内皮细胞骨架蛋白结构和分布改变中的作用实验发现,PI-PLC抑制剂ET18-OCH3、IP3R抑制剂2APB和钙离子通道抑制剂RR处理细胞30 min, ET18-OCH3和2APB处理组ZO-1和F-actin环状结构严重断裂、破碎,细胞边界不清楚,几乎失去正常细胞形态,胞内ZO-1内化明显,出现大量丝状应力纤维,细胞间可见大量空隙,而RR处理组较正常对照组变化不大。实验还发现,分别用ET18-OCH3.2APB预处理细胞30 min,再用0.5μmol/L S1P刺激细胞30 min,发现可部分恢复ET18-OCH3或2APB单独作用对细胞ZO-1和F-actin的结构和分布产生的破坏,但未恢复到对照组或0.5μmol/L S1P单独作用组的水平；另外,用RR预处理细胞30 min,再用10.0μmol/LS1P刺激细胞30 min,发现内皮细胞ZO-1和F-actin的结构和分布较10.0μmol/LS1P单独作用组有一定改善,但亦没有恢复到对照组水平。结果提示,内钙释放对于维持内皮细胞形态结构和细胞间连接有着非常重要的意义,外钙内流的作用不大；内钙释放可能参与介导了低浓度S1P对内皮细胞形态结构和细胞间连接的保护,外钙内流可能参与了高浓度S1P对内皮细胞形态结构和细胞间连接的破坏。四、S1P介导内皮屏障功能的变化及其机制1.不同浓度S1P对内皮屏障功能的影响实验发现,低浓度(0.1 μmol/L,0.5μmol/L,1.0μmol/L) SIP刺激导致内皮细胞单层TEER明显升高,以0.5μmol/L SIP刺激组TEER最高,其中0.1μmol/L和0.5μmol/L SIP组与无任何刺激的空白对照组相比有统计学意义(P<0.05)；高浓度(10.0 μmol/L) SIP刺激导致内皮细胞单层TEER明显降低(P<0.05)。结果提示,低浓度S1P刺激可导致内皮TEER升高,屏障功能增强；高浓度S1P导致内皮TEER降低,屏障功能减弱。2.受体在S1P介导的内皮屏障功能变化中的作用发现较0.5 μmol/L S1P单独作用组,S1PR1拮抗剂VPC23019预处理降低了0.5μmol/L S1P引起的TEER升高(P<0.05)；较10.0 μmol/L S1P单独作用组,S1PR2拮抗剂JTE013预处理减弱了10.0 μmol/L S1P引起的TEER降低(P<0.05)。结果提示,S1PR1参与介导了低浓度S1P对内皮屏障功能的保护作用；S1PR2参与介导了高浓度S1P对内皮屏障功能的破坏作用。3. Racl和ROCK在S1P介导的内皮屏障功能变化中的作用结果发现,较0.5 μmol/L S1P单独作用组,Racl抑制剂NSC23766预处理降低了0.5 μmol/L S1P引起的TEER升高(P<0.05)；较10.0μmol/L S1P单独作用组,ROCK抑制剂H1152预处理减弱10.0 μmol/L S1P引起的TEER降低(P<0.05)。结果提示,Racl参与介导了低浓度S1P对内皮屏障功能的保护作用；ROCK参与介导了高浓度S1P对内皮屏障功能的破坏作用。4.钙离子在生理浓度S1P介导的内皮屏障功能变化中的作用结果发现,与对照组相比,ET18-OCH3、2APB预处理细胞导致了TEER的下降(P<0.05),以预处理30 min时最为明显,RR预处理细胞无此效应；加入0.5 μmol/L SIP后,ET18-OCH3、2APB预处理细胞引起的TEER的下降得到了明显纠正,但与0.5μmol/L SIP单独作用组相比,TEER明显偏低(P<0.05),RR预处理细胞与0.5 μmol/L S1P单独作用组相比无明显差异。结果提示,内钙释放参与介导了生理浓度S1P对内皮屏障功能的维持和保护作用。5.钙离子在高浓度S1P介导的内皮屏障功能变化中的作用结果发现,与对照组相比,ET18-OCH3、2APB预处理细胞导致了TEER的下降(P<0.05),以预处理30 min时最为明显,RR预处理细胞无此效应；加入10.0 μmol/L SIP后,ET18-OCH3、2APB预处理组TEER进一步的下降,RR预处理组TEER与10.0 μmol/L S1P单独作用组相比得到明显恢复(P<0.05)。结果提示,外钙内流参与介导了高浓度S1P对内皮屏障功能的破坏作用。结论1.生理剂量(0.1、0.5、1.0μmol/L)的S1P激活S1PR1,引起细胞内质网的钙释放,细胞内钙离子浓度升高,导致Racl的移位和激活,引起细胞骨架蛋白在细胞周边聚集,加强细胞间连接结构和屏障的完整性；2.过量(10.0 μmol/L) SIP:激活S1PR2,引起细胞外钙内流入细胞,细胞内钙离子浓度升高激活RhoA,介导细胞骨架蛋白的收缩,形成应力纤维,细胞间连接松懈和屏障功能损伤。