瞬时受体势(transient receptor potential, TRP)通道是人类感觉系统的先驱,可以响应从细胞内至细胞外的多种刺激,因此被称为多觉感受器。TRP通道分布广泛,调节机制多样,近年来已明确TRP通道在温度感觉中起重要作用,温度敏感型TRP通道通常表达在感觉神经末稍,除了可被温度激活外,还可被多种物理或化学刺激激活,激活的温度敏感型TRP通道不但介导温度感知,而且还参与痛觉的形成和传导、痒觉发生以及皮肤神经源炎症发生。因此,温度敏感型TRP通道已成为治疗痛觉、炎症性皮肤病和瘙痒等疾病的重要新型分子靶标。离子通道通过参与调节细胞膜内、外离子浓度的变化以及膜电位的建立,在许多生理过程中发挥着重要作用。离子通道类疾病的发生通常都是由于离子通道功能的异常导致细胞电生理特性的改变引起的。比如,研究发现热敏型TRPV3通道基因的缺失会导致毛发生长异常和皮肤病的发生,而TRPV3通道的获得性功能突变则导致人类奥姆斯特德遗传性疾病(Olmsted syndrome);热敏型TRPV1通道主要参与痛觉的产生和传导,TRPV1敲除小鼠缺失了由炎症物质引起的热痛过敏反应。因此,对离子通道的门控(开和关)过程进行调节或控制不仅是离子通道研究的核心内容,同时还为离子通道病的致病机理与临床治疗提供理论指导。基于热敏TRPV3和TRPV1通道在维持机体生理功能中的重要作用,本研究综合利用膜片钳电生理、分子生物学和生物化学等多项技术手段开展了靶向TRPV3和TRPV1通道门控调节的研究工作,内容如下：第一部分,H+对热敏型TRPV3通道门控调节的作用机制研究。热敏TRPV3通道在角质细胞、三叉神经节和大脑等组织中均有大量表达。温度和一些化学性刺激均可引起通道开放。组织细胞酸化是机体生理及病理条件下的常见现象。剧烈运动时,骨骼肌无氧糖酵解增强而引起乳酸的积聚,导致细胞外液pH值降低；组织损伤、缺氧、癫痫、感染等状态下也常伴有细胞外液pH值的降低。已有研究结果表明酸性pH不仅可以直接激活TRPV1通道,同时还可以敏化TRPV1通道对其它激动剂的响应。现有研究结果表明酸性pH不能够从细胞膜外侧直接激活与TRPV1通道同亚家族的热敏TRPV3通道,但酸性pH是否能够调节TRPV3通道的功能仍不清楚。为此,本研究首先开展了H+对热敏TRPV3通道的调节作用研究。研究结果如下：1)H+能够显著地增强TRPV3通道活性,酸性条件下,通道激动剂2-APB的浓度依赖性曲线左移,即H+能够敏化2-APB激活TRPV3通道的能力；2)将TRPV3通道处于细胞膜外侧的带负电荷氨基酸(酸性氨基酸)残基逐一作中性化突变,膜片钳实验记录结果显示所有的中性化突变均不改变H+对TRPV3通道的敏化作用；3)H+虽然不能从细胞膜外侧直接激活TRPV3通道,却可以从细胞膜内侧激活TRPV3通道,但不能从细胞膜内侧激活TRPV1和TRPV2通道；进而利用TRPV3和TRPV1通道胞内侧对H+激活作用的差异性,通过构建了一系列TRPV3与TRPV1嵌合体,发现处于细胞膜内侧的TRPV3通道Linker 2-3上的四个氨基酸残基(L508,D512,S518和A520)对H+的激活作用具有重要作用；4)离体膜片钳实验表明,不管膜片外侧处于中性还是酸性环境下,H+从膜片内侧都能够增强2-APB激活TRPV3通道的能力,综合以上实验说明H+对TRPV3通道的增强作用依赖于激动剂,而非通道蛋白；5)H+对TRPV3通道电流的增强作用具有激动剂种类的特异性,仅增强由2-APB及其类似物激活TRPV3通道的能力；进而通过核磁共振实验对2-APB的几种类似物在不同pH值的溶液中的一维和二维H谱进行检测,结果发现酸性条件下2-APB,DPBA和DPB在芳香区的H谱发生了明显位移,而不含有硼元素化合物DPM的H谱没有明显改变。进一步对NMR和MS的结果分析发现：酸诱导的结构转换涉及到了质子的添加或者OH-的移除,2-APB作为一个路易斯酸,含硼化合物能够在中性或者碱性条件下接受OH-；而H+的存在则消除了OH-的影响,使得2-APB的空间构型由四面体结构(4个sp3杂化轨道)转变为平面三角形结构(3个sp2和一个空p轨道)。此外,酸不仅改变了2-APB中苯环的取向,同时硼与苯环之间的键角也发生了改变。6)最后,我们还发现H+同样能够增强2-APB对TRPM8通道的抑制作用。论文第二部分开展了1,4-二恶烷(1,4-Dioxane)对热敏型TRPV1通道门控调节的作用机制研究。辣椒素受体TRPV1通道是目前研究的最多的TRP通道家族成员之一。TRPV1通道广泛存在于酵母到人类等多种物种,主要分布在脑组织和初级感觉传入神经末梢,在一些非神经组织如皮肤角质细胞、胃肠道、干细胞、成纤维细胞、T细胞、肥大细胞和血管平滑肌等细胞组织中也有表达,在痛觉传递和调制,整合多种疼痛信息等方面发挥重要作用。1,4-Dioxane在日常生活或实验研究中作为溶剂被广泛应用,作为乙酰化过程的副产物在个人的日常护理产品中也不可避免的存在。许多动物实验研究明确了1,4-dioxane对健康的危害,小鼠饮用水中长期摄入低浓度1,4-Dioxane或急性吸入高浓度1,4-Dioxane对动物中枢神经,肝脏和肾脏都会造成损伤,人急性吸入高浓度的1,4-Dioxane会引起头晕,对眼,鼻,喉和肺产生刺激作用,对人类皮肤也有损伤,但目前1,4-Dioxane的分子靶标仍不明确。鉴于TRPV1通道在感觉神经系统,消化系统,免疫系统以及皮肤中的广泛表达和重要作用,在论文的第二部分我们研究了1,4-Dioxane对热敏TRPV1通道可能的调节作用。取得如下实验结果：1)高浓度1,4-Dioxane对外源表达的TRPV1通道有激活作用,而低浓度1,4-Dioxane则能够增强其它激动剂激活TRPV1通道的能力,特别是能够降低TRPV1通道的温度激活阈值；2)在TG(三叉神经节)和DRG(背根神经节)神经元中,1,4-Dioxane同样能够激活内源表达的TRPV1通道电流,并增强辣椒素对TRPV1通道的激活作用；3) TRPV1通道的质子化和磷酸化(分别模拟炎症条件和痛觉敏化状态)能够显著地增强1,4-Dioxane激活TRPV1通道的能力,暗示在炎症状态或痛觉过敏时,1,4-Dioxane能够对机体造成更大的伤害；4)野生小鼠和TRPV1通道敲除小鼠的热板实验和Von Frey实验结果表明1,4-Dioxane能够引起TRPV1通道依赖性的热痛觉过敏行为,而对小鼠的机械痛阈则无影响；5)我们进一步检测了1,4-Dioxane对TRPV1通道序列同源性较近的温度敏感型TRPV2和TRPV3通道,以及对冷敏型TRPM8通道的调节作用,结果表明1,4-Dioxane同样能够激活TRPV3通道,但对TRPM8通道却起抑制作用,对TRPV2通道则无调节作用,说明1,4-Dioxane对TRP通道的调节作用具有差异性；6)利用1,4-Dioxane对TRPV1和TRPV2通道激活作用的差异性,通过构建一系列TRPV1与TRPV2嵌合体(对应片段互换),发现TRPV1通道Linker 4-5区段在1,4-Dioxane对TRPV1通道的激活中具有关键性作用,而该区段的E570则起主要作用；7)最后,我们进一步检测了与1,4-Dioxane结构类似,且在工业生产或日常生活中同样有广泛应用的1,3-Dioxane,四氢呋喃以及1,3,5-Trioxane对TRPV1通道的作用,研究发现除了1,3,5-Trioxane,其它两种物质均能激活TRPV1通道,表明该类物质具有类似的作用。本部分所取得的研究结果表明：1,4-Dioxane对外源或内源表达的痛觉感受器TRPV1通道不仅具有直接激活作用,同时还能够敏化其它激动剂激活TRPV1通道的能力,研究结果提示1,4-Dioxane可以通过作用于TRPV1通道,从而引起机体的痛觉反应进而造成其它伤害。同时,我们的研究还发现1,4-Dioxane能够敏化和激活皮肤中广泛表达的TRPV3通道,而TRPV3通道功能紊乱会引起各种皮肤问题并影响毛发的正常生长,而1,4-Dioxane作为乙酰化过程的副产物,不可避免的存在于许多盥洗用品和化妆品中,提示人们应严格控制与皮肤直接接触的物质中1,4-Dioxane的含量。综上,通过应用多种研究手段,本文阐明了H+调节TRPV3通道功能的机制,而且该调节机制可推广到TRPV1和TRPV2通道,即通过改变激动剂2-APB的构象而增强2-APB对热敏型TRPV1-3通道的激活能力,同时还明确了酸在TRPV3通道胞内侧的4个激活作用位点(L508,D512,S518和A520)：此外,还成功揭示热敏型TRPV1和TRPV3通道为1,4-Dioxane在机体内的分子作用靶标,为1,4-Dioxane对机体健康的潜在损伤提供了相应的理论解释,并为1,4-Dioxane的使用规范提供了一定的理论依据。