研究背景免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)在儿童时期比较常见。为一种良性出血性疾病[1],其发病率约为(4-5)/10万,临床上以外周血血常规中血小板计数减少,伴或不伴出血症状为主要特点。目前其发病原因尚未完全清楚,诊断该疾病仍然是排除性诊断[2-3]。研究发现,多数ITP患儿的预后一般良好。但约10%-20%的ITP患儿虽经正规治疗,最终仍有可能向慢性ITP甚至是难治性ITP转化。因此我们仍需对ITP发病机制及治疗进行探讨。Th17细胞是一种新的CD4+T淋巴细胞亚型。Th17细胞可分泌多种类型的细胞因子。其中较为典型的是白介素17(IL-17)。IL-17是一种重要的促炎性细胞因子,近年来成为研究的热点。其具有多重生物学活性。IL-17一方面可以诱导中性粒细胞的增殖、成熟及趋化,促进机体内多种类型的促炎性细胞因子产生。另一方面又可以通过和其他一些细胞因子的相互作用,进而引起细胞浸润和组织破坏,影响感染、肿瘤和自身免疫疾病等的病理发展过程[4-5]。综合各方面文献发现,Thl7细胞与再生障碍性贫血[6-8]、类风湿性关节炎[9-11]、系统性红斑狼疮[12]、银屑病[13-14]、慢性乙型病毒性肝炎[15-17]等多种自身免疫性疾病的发生及进展均有一定程度的相关性。调节性T细胞(Treg细胞)可分为两种类型,一种是胸腺来源的天然型CD4+CD25+Treg细胞。另一种是外周诱导型CD4+CD25+Treg细胞。研究发现Treg细胞与Th17细胞无论在分化上还是功能上均相互拮抗。Treg细胞主要在机体免疫防御及稳定维护中发挥重要作用。有学者提出,Treg细胞与Thl7细胞比例失衡可能是导致ITP发生的一个关键因素,但目前这方面的研究较多集中在成人ITP。儿童ITP中关于Th17/Treg细胞比例失衡的研究则相对较少,并且结论尚存在争议,并无比较确切的说法。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)在临床上并不少见。细胞或其他生物离子被免疫荧光标记后通过流动室进行检测,可实现高速的细胞定量分析和分选。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是临床上较为经典的检测方法。是一种特异性强、灵敏度高的标记免疫技术。目前在临床疾病的诊断及治疗中被不断应用。研究目的本研究采用流式细胞术方法检测初诊ITP患儿丙种球蛋白治疗前后及健康对照组儿童外周血中Th17细胞、Treg细胞分别占CD4+T淋巴细胞的比例,酶联免疫吸附法(ELISA)检测外周血血浆中IL-17、IL-23的水平。旨在探讨Th17/Treg细胞比例失衡在儿童免疫性血小板减少症发病及治疗中的作用,进一步为ITP的靶向治疗提供新的思路。研究方法收集2015.05.01-2015.08.31在郑州市某综合性三级甲等医院儿科门诊及病房就诊的ITP患儿32例作为实验组,同期在我院体检的22例健康儿童作为正常对照组。所有ITP患儿的家长均知情同意。行骨髓穿刺检查后,骨穿结果均符合我国2011年中华医学会制定的ITP诊断标准[18-19]。同时排除如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、白血病、骨髓衰竭性疾病等其他引起血小板减少的血液系统疾病,病毒性肝炎、活动性感染及结缔组织病等疾病引起的血小板减少也需要排除在外。实验组与对照组儿童年龄、性别均具有可比性。所有患儿临床资料完整,且无家族遗传病史。受试儿童家长均知情同意。所有标本均于标本采集后8h内进行处理。合并感染的患儿应先控制感染。在感染控制后再进行进行标本采集。初诊ITP患儿治疗前、丙种球蛋白应用后及对照组儿童分别于清晨空腹抽取肝素钠抗凝外周血4ml。其中1ml置于干燥无酶的EP管中,以1500r/min的速度在低速离心机中离心5分钟,然后取上清液置于-80°冰箱中放置用于ELISA测定,剩余3ml用于流式细胞术相关检测。(1)流式细胞术检测各组患儿外周血单个核细胞中Th17细胞、Treg细胞分别占CD4+T细胞的比例,采用ELISA法测定外周血血浆中IL-17、IL-23的水平,采用独立样本的t检验将ITP组与正常对照组进行比较;采用直线相关方法分析相应细胞因子与细胞所占比例间的相关性。(2)ITP患儿丙种球蛋白治疗前后进行Th17细胞、Treg细胞分别占CD4+T细胞的比例及Th17/Treg比例之间的比较;治疗后的ITP患儿按效果可以分为完全反应组、有效组、无效组、激素依赖组,将有效组与无效组之间Th17细胞、Treg细胞分别占CD4+T细胞的比值及Th17/Treg比例进行比较。结果1.初诊ITP患儿外周血单个核细胞中Th17细胞占CD4+T细胞的比例为(2.03±0.55)%,Th17/Treg细胞的比例为(0.99±0.58)%,均显著高于正常对照组儿童(0.54±0.21)%、(0.71±0.35)%(P<0.05);ITP患儿Treg细胞占CD4+T细胞的比例为(2.49±0.86)%,显著低于同龄正常对照组(8.14±0.86)%(P<0.05);2.初诊ITP组患儿外周血血浆中IL-17、IL-23的水平分别为(80.75±12.98)ng/L、(13987.26±2200.18)ng/L,均显著高于正常对照组(21.64±4.20)ng/L、(9143.31±3219.17)ng/L(P<0.05),且血浆IL-17、IL-23的水平与Th17细胞占CD4+T细胞的比例呈正相关(r=0.54,P<0.01;r=0.46,P<0.05),与Treg细胞占CD4+T细胞的比例呈负相关(r=-0.60,P<0.01;r=-0.52,P<0.01)。3.ITP患儿治疗前外周血单个核细胞中Th17细胞占CD4+T细胞的比例为(2.03±0.55)%、Th17/Treg细胞比例为(0.99±0.58)%,均显著高于丙种球蛋白治疗后(0.96±0.45)%、(0.18±0.16)%(P<0.05);Treg细胞占CD4+T细胞的比例为(2.49±0.86)%,显著低于治疗后(4.54±0.95)%(P<0.05)。丙种球蛋白治疗后ITP患儿按治疗效果可分为完全反应组、有效组、无效组,完全反应组患儿外周血中Th17细胞的比例、Th17/Treg细胞的比值显著低于无效组[(0.69±0.36)%)vs(1.51±0.45)%(P<0.05);(0.14±0.07)%)vs(0.52±0.27)%(P<0.05],Treg细胞占CD4+细胞的比例两者之间相比则无统计学意义。[(3.59±0.92)%vs(5.21±0.78)%(P>0.05)]。结论1.儿童免疫性血小板减少症患儿外周血中存在Th17/Treg细胞比例失衡,相关细胞因子IL-17、IL-23在该通路中发挥了重要作用,为ITP的靶向治疗提供了思路;2.丙种球蛋白冲击治疗可能通过调节Th17/Treg细胞的比例的变化,进而调节ITP患儿细胞免疫功能而达到治疗目的。治疗过程中检测Th17/Treg细胞比例的变化可能对ITP的治疗效果有一定的预测作用。