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【目的】运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从正常大鼠肝组织扩增出HP450基因,并构建pMD18-HP450重组克隆载体和pLXSN-HP450表达载体,为下一步对HP450基因进行肝癌基因治疗的体内外实验打下基础。【方法】1.用Trizol试剂从正常大鼠肝组织中提取总RNA,用RT-PCR技术扩增出HP450基因,并克隆到到pMD18-T载体,经蓝白斑筛选及PCR,酶切,测序鉴定得到阳性克隆。2.用限制性内切酶BamHI、EcoRI双酶切构建好的重组质粒pMD18-HP450切出HP450基因,并和用此双酶酶切的逆转录病毒载体pLXSN在16℃下经T4连接酶连接过夜,并转化到感受态细胞DH5α,经以菌液为模板做PCR,结合酶切实验筛选出阳性重组逆转录病毒载体pLXSN-HP450。【结果】1.提取的总RNA保持完整,纯度高。2. RT-PCR扩增出长度为1461bp的HP450基因。HP450基因与载体pMD18-T质粒经T-A连接,转化,蓝白斑筛选后,阳性克隆的菌液经PCR扩增出1,461 bp的目的基因,提取的重组质粒pMD18-HP450经内切酶BamHI、EcoRI酶切后,得到1,461 bp的酶切产物。测序的结果用European Bioinformatics Institute的Clustal W在线与Genebank对比,此目的基因与基因库中的H1基因100%同源。3.分别经BamHI、EcoRI双酶酶切的重组质粒pMD18-HP450和逆转录病毒载体pLXSN,经过连接转化,抗生素筛选得到阳性克隆,用其菌液PCR扩增出1,461 bp左右的条带。用BamHI、EcoRI双酶对逆转录病毒载体pLXSN-HP450进行酶切得到1,461 bp和5,900 bp两条特异性条带。【结论】扩增了HP450基因,并构建了重组逆转录病毒载体pLXSN-HP450,为进一步研究肝癌的基因治疗奠定了基础。