论文部分内容阅读
牙周炎是一种病因复杂，受全身防御机制调控和各种局部因素影响，由多种因素共同作用的牙周组织破坏性疾病，咬合创伤是其局部促进因素之一。人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLF)是牙周膜中主要的感受性细胞和效应性细胞，其增殖活性直接反映了牙周组织的健康状态，目前有关力学刺激细胞增殖及其复杂调控机制的研究尚不深入。核因子-κB(unclear factorκB，NF-κB)是真核细胞内一类重要的转录因子，周期性张应力能否通过NF-κB信号通路，将细胞外信号传递到细胞核内引起hPDLF增殖，对其机制具有指导意义。
目的：本实验采用多通道细胞牵张应力加载系统对体外培养的hPDLF施加不同时间的周期性张应力，观察其对hPDLF增殖的影响；阐明NF-κB在应力介导的hPDLF增殖中的作用及其机制，明确周期性张应力、hPDLF增殖、NF-κB三者之间的关系；为诠释咬合创伤的致病机理以及探寻咬合创伤所致牙周炎干预治疗的关键靶点提供理论依据和新的思路。
方法：1．采用多通道细胞牵张应力加载系统，以hPDLF为对象构建细胞体外培养-力学刺激模型。
2．加力组分别加载周期性张应力1、2、4、6、12、24h，幅度为10％(每一个循环包括3s-stretch/3s-relaxation)，频率为0.1Hz(6cycles/分)，并以不加力组为实验对照组。应用细胞计数试剂-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)检测hPDLF增殖的情况；流式细胞技术检测hPDLF细胞周期的变化；应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和NF-κB mRNA的表达以及应用NF-κB的特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)预处理的细胞作为对照组，检测hPDLF增殖的情况。
3．应用蛋白印迹法(Western-blot)检测各组hPDLF中的NF-κB抑制蛋白I-κBα(Inhibitor kappa B，I-κBα)蛋白的表达情况；应用PDTC预处理的细胞作为对照组，检测I-κBα蛋白的表达。
结果：1．体外培养获得了典型且具有稳定增殖特征性的hPDLF，适于对细胞进行力学加载实验。
2．相对于静态组：1、2h，加力组hPDLF增殖下降，差异无统计学意义（P＞0.05）；6h开始增殖，12h增殖达高峰，24h增殖受到明显的抑制；PDTC抑制细胞增殖以及PCNA和NF-κBmRNA的表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3．静态组胞浆IκBα蛋白有较强的表达，加载12h后，胞浆I-κBα蛋白表达明显减少；加入PDTC后，胞浆I-κBα蛋白表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论：1．成功构建hPDLF体外培养-力学刺激模型。
2．加载幅度10%、频率0.1Hz的周期性张应力，在一定时间范围内能促进体外培养的hPDLF增殖；当超过一定时间时，细胞增殖受到明显抑制；NF-κB信号通路参与调控细胞的增殖状态，并在其中发挥重要作用。
3．周期性张应力可使胞浆I-κBα蛋白表达水平的降低，胞浆I-κBα降解是NF-κB信号通路活化的机制之一。