目的设计通用引物和通用探针，使用聚合酶链反应技术(普通PCR，实时荧光定量PCR)快速鉴定类杆菌属细菌，并测定该菌属的16S rRNA基因序列，建立基因进化树，分析不同来源分离菌株之间的进化差异、分离菌株和标准菌株之间的进化差异。研究方法1．根据临床上常见类杆菌的标准16S rRNA基因序列，在其序列保守区设计通用引物和通用探针，并验证引物和探针的特异性。2．使用脆弱类杆菌、多形类杆菌、普通类杆菌、卵圆类杆菌为阳性对照株(共13株)，以肠道需氧菌、G~+球菌、梭杆菌、长双歧杆菌DQ259034、大肠埃希菌ATCC25922(共45株)，及人类单个核细胞基因组DNA、HBV-DNA等为阴性对照，建立普通PCR和实时荧光定量PCR的方法，快速鉴定类杆菌。3．普通PCR产物基因测序，所测序列之间以及和相应的标准株16S rRNA基因序列之间做比对，构建基因进化树。4．采用细菌直接计数法制作标准品建立实时荧光定量PCR方法，同时和PCR产物作为标准品的定量检测同一标本的结果比较。5．类杆菌的PCR鉴定结果和表型鉴定结果对比分析。结果1．建立了普通PCR和实时荧光定量PCR反应体系。普通PCR和实时荧光定量PCR能特异的检测脆弱类杆菌，多形类杆菌，普通类杆菌，卵圆形类杆菌。而40株肠道需氧菌、G~+球菌、梭杆菌、长双歧杆菌DQ259034、大肠埃希菌ATCC25922、人类单个核细胞基因组DNA、HBV-DNA等无电泳条带和检测信号出现。2．普通PCR能检测到100个细菌的基因组DNA／μl，实时荧光定量PCR能检测到10个细菌的基因组DNA／μl。3．做了实时荧光定量PCR检测类杆菌的批内和批间重复性实验。用细菌浓度分别为10~4、10~5个细菌基因组／μl，做批内，批间重复性实验，每个浓度测5次，使用Ct(循环域值)值的变异系数表示实验的重复性。10~4个细菌基因组／μl的批内重复性：CV(变异系数)值为0.704％，批间重复性CV值为3.49％；10~5个细菌基因组／μl的批内重复性：CV值为0.74％，批间重复性CV值为1.19％。4．用细菌直接计数法制作标准品和PCR产物制作标准品分别建立荧光定量PCR反应体系，以10~3个细菌／μl为检测标本，做实时荧光定量PCR。细菌直接计数法制作标准品的检测结果为为763.8个细菌／μl，PCR产物制作标准品的检测结果为112.9个细菌／μl。5．有三株细菌表型鉴定和PCR鉴定结果不一致。6．基因进化树和Blast结果表明，同种分离株的16S rNA基因序列之间以及和相应的标准的16S rNA基因序列之间的遗传学距离有一定的差异。结论1．建立的普通PCR和实时荧光定量PCR体系能特异性地检测类杆菌，普通PCR的检测灵敏性达到了100个细菌基因组／μl，实时荧光定量PCR能检测到10个细菌的基因组DNA／μl。2．建立的实时荧光定量PCR体系有很好的重复性，批内，批间变异系数都在5％以内。3．细菌直接计数法制作标准品做实时荧光定量PCR检测标本比使用PCR产物制作标准品做实时荧光定量PCR检测标本的结果更接近实际结果。4．表型鉴定与分子生物学鉴定相比存在一定的误差。5．同种但不同来源的菌株之间的16S rRNA基因并不完全相同。