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研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种常见的危害人类健康的心血管疾病,胆固醇等脂质代谢紊乱是导致AS发生发展的重要因素,寻找通过调控胆固醇等脂质代谢平衡从而防治AS发生发展的新靶点具有重要的意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是不具有编码蛋白质功能且长度大于200nt的RNA,研究发现lncRNA在个体生长发育和细胞生命活动中发挥重要作用。有研究表明一些lncRNA通过参与调控血管形成、脂质代谢以及炎症反应从而影响AS的发生发展。HOXC6属于同源盒基因家族(homeobox family)成员,该家族编码的蛋白在多细胞生物的形态发生中起重要作用。有研究表明其部分家族成员参与调控血管形成、内皮细胞迁移和脂肪组织形成等过程。由减肥手术引起的脂肪减少会促进HOXC6的表达。然而,关于HOXC6与AS之间的关系还未见报道。研究方法1、细胞培养(1)THP-1细胞培养:生长于含10%胎牛血清的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640培养基,加入一定量青霉素和链霉素,置于培养箱中培养。(2)诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞:用浓度为100ng/ml的佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)处理 THP-1 细胞,24-48h 后 THP-1 单核细胞分化成为巨噬细胞。2、组织来源8例无动脉粥样硬化斑块的正常动脉内膜组织和8例有动脉粥样硬化斑块的内膜组织标本在2013年4月至2014年4月期间采集自南方医科大学南方医院。3、RNA的提取和实时荧光定量PCR使用TRIzol试剂盒提取人动脉内膜组织和细胞的总RNA,逆转录为cDNA。在ABI 7500 FAST PCR仪上进行实时定量PCR反应。4、免疫印迹蛋白提取试剂盒提取细胞和人动脉内膜组织的蛋白,10%琼脂糖凝胶电泳将目的蛋白分离,按顺序进行电泳、湿转膜、封闭、孵育一抗、洗膜、孵育二抗,曝光显影,根据相对灰度值计算目的蛋白的相对表达量。5、病毒构建和转染HOXC-AS1过表达慢病毒载体(LV-HOXC-AS1)和相应的对照载体(LV-Mock)由莱德尔生物有限公司构建合成。转染时感染复数为100。6、高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)按照说明书进行检测,检测216nm处吸光度。结果用TotalChrom software软件进行数据分析。7、统计分析计量数据用均数±标准差(x±s)表示,各蛋白免疫印迹条带相对灰度值、1ncRNA和基因mRNA相对表达量的比较采用两独立样本t检验。每组实验重复5次,采用SPSS 17.0统计软件分析数据,P<0.01认为差异有统计学意义。结果1、IncRNA HOXC-AS1和HOXC6在动脉粥样硬化斑块中表达下降。我们首先采用基因芯片检测3对动脉粥样硬化斑块组织和正常动脉内膜组织中差异表达的RNA。结果显示,lncRNAHOXC-AS1在斑块组织中下降31.77倍,HOXC6下降4.64倍。在5对动脉粥样硬化斑块和正常动脉内膜组织中进行验证,qRT-PCR和免疫印迹结果显示lncRNAHOXC-ASl和HOXC6在斑块中表达水平下降。2、IncRNA HOXC-AS1促进THP-1巨噬细胞中HOXC6表达。生物信息学分析发现lncRNAHOXC-AS1和HOXC6基因定位于同一条染色体并且转录方向相反。在THP-1巨噬细胞中转染1ncRNA HOXC-AS1过表达慢病毒载体,qRT-PCR和免疫印迹结果显示HOXC6的mRNA和蛋白水平上调。3、OX-LDL抑制THP-1巨噬细胞中IncRNAHOXC-AS1和HOXC6CD的表达。用50μg/mlOX-LDL分别处理THP-1巨噬细胞Oh、12h、24h和48h,结果表明在48h以内,OX-LDL能够时间依赖性地下调1ncRNA HOXC-AS1和HOXC6的表达水平。此外,OX-LDL对HOXC6的抑制作用能够被lncRNAHOXC-ASl逆转。4、IncRNA HOXC-AS1能够部分消除OX-LDL对胆固醇蓄积的促进作用。采用高效液相色谱(HPLC,High Performance Liquid Chromatography)检测细胞内胆固醇含量,结果显示50μg/ml OX-LDL上调THP-1巨噬细胞中总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离胆固醇(free cholesterol,FC)和胆固醇酯(cholesterol ester,CE)水平。此外,OX-LDL对胆固醇的上调作用能被IncRNA HOXC-AS1部分抑制。