I.背景胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在癌症相关的疾病中,胃癌是导致男性死亡的第三大死因；也是女性死亡的第五大原因。胃癌在发展中国家中高发,占世界发病率的三分之二,这些国家包括日本,中国,南美,东欧,以及中东地区等。在中国,胃癌的发病率较高,占全世界的所有胃癌病例的42%。幽门螺杆菌(且pylori)是导致慢性胃炎、胃溃疡和胃癌的主要因素之一。H. pylori属于革兰氏阴性需氧菌,属于螺旋形杆菌有鞭毛结构。世界上50%以上的人口有幽门螺旋杆菌感染,但是由感染引起的胃癌发病率较低。在发展中国家,80%的人口被感染,而发达国家的感染率为20-50%。幽门螺旋杆菌细胞毒素相关抗原A(H.pylori cytotoxin associated antigen A, Cag A)是细菌的癌蛋白,在胃癌的发展中发挥重要的作用。Cag A的分子量是128kDa,由幽门螺旋杆菌的40kb的CAG-致病岛(cag-pathogenicity island, cag PAI)所编码。Cag A是由Ⅳ型分泌系统分泌,在进入胃上皮细胞之后,发生磷酸化反应,通过促进细胞散射而导致幽门螺旋杆菌相关的疾病的发生。某些糖链在胃癌细胞表面异常表达,如ABH血型抗原和Lewis相关糖抗原等。岩藻糖是的糖链的重要成分之一,参与合成一些重要的生长因子受体,在胃癌发展的过程中发挥重要作用。岩藻糖基化在肿瘤发生发展过程中有重要的作用。研究发现,岩藻糖基化反应在许多癌症中,如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和胃癌异常增高。岩藻糖基转移酶IV(fucosyltransferase Ⅳ, FUT4)是路易斯Y(LewisY,LeY)合成的关键酶。LeY是双岩藻糖化的寡糖,在60--90%的上皮来源的癌症中高表达。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的糖基化反应在肿瘤细胞增殖的过程中起着重要的作用。幽门螺旋杆菌感染后,能抑制EGFR的活化,调节细胞的增殖,分化和凋亡。由于缺乏特异的诊断指标和有效的治疗手段导致胃癌具有高的死亡率。在中国,胃癌的发病率很高,是癌症死亡的首要原因。尽管近年来胃癌的治疗方法改进,但仍然有较高的转移率和死亡率。因此,发现新的生物标记物对于诊断和治疗幽门螺旋杆菌感染及预防胃癌具有重大的意义。塞来昔布(Celecoxib)是环氧化酶2(Cyclooxygenase2, COX-2)抑制剂,可以通过下调的环氧化酶-2(COX-2)的表达抑制胃癌细胞的增殖。COX-2的在不同类型的癌症(包括胃癌)高表达。在胃癌中,H. pylori通过增加COX-2的表达调节细胞增殖和凋亡。但是塞来昔布的治疗效果差,这限制了塞来昔布在临床的应用性。因此,制定更好的策略来提高塞来昔布的疗效有重要的临床意义。LeY寡糖抗体在临床上广泛应用来治疗不同类型的癌症。因此,联合使用塞来昔布和LeY寡糖抗体可能有效地治疗胃癌。人参皂苷(Ginsenoside, Rg3)是中国草药,能抑制细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。SP1和HSF1是FUT4的转录因子,在LeY寡糖合成调解过程中发挥重要作用。前期研究发现,Rg3通过SPl和HSF1下调FUT4的表达,从而诱导胃癌细胞的凋亡。而CagA与岩藻糖基转移酶在胃癌中的相互关系尚未明确。在本文中,我们分析CagA与岩藻糖基转移酶的相关作用及其作用机制。此外,讨论联合塞来考昔、LeY寡糖抗体和Rg3在细胞增殖和凋亡中的治疗效果。II.目的1.我们通过对胃炎,胃溃疡和胃癌组织和血清样品分析讨论CagA与EGFR的激活、FUT4口LeY寡糖之间的内在联系。此外,研究H, pylori中CagA促进胃癌细胞增殖的作用机制。2.我们在胃癌患者的组织和血清样品中研究H. pylori与COX-2及胃癌诊断标记物(CA724,和GRN)的相关性;及联合使用塞来昔布和LeY寡糖抗体对胃癌细胞增殖的抑制作用。3.讨论Rg3治疗胃癌的作用机制。III.实验方法1.我们运用免疫组化分析胃炎,胃溃疡和胃癌组织和血清样品中Cag A与pEGFR、FUT4、COX-2、CA724、GRN及H. pylori的相关性。2.我们运用ELISA分析胃炎,胃溃疡和胃癌组织和血清样品中Cag A与pEGFR. FUT4、COX-2、CA724、GRN及H. pylori的相关性。3.利用人胃癌细胞株(SGC-7901)进行体外实验,通过Western Blot研究CagA对细胞增殖的影响。4.我们通过免疫染色分析在SGC-7901细胞中Cag A对细胞增殖的影响。5.我们通过ELISA讨论在SGC-7901细胞中Cag A对细胞增殖的影响。6.我们通过流式细胞术研究在SGC-7901细胞中Cag A对细胞增殖的影响。7.我们鉴定并培养胃癌原代细胞,用塞来昔布、LeY寡糖抗体及联合塞来昔布和LeY寡糖抗体处理细胞,通过Western Blot检测COX-2. CA724和GRN的表达。8.我们通过ELISA分析COX-2. CA724和GRN的在胃癌原代培养的细胞中的表达变化。9.我们通过流式细胞术分析COX-2, CA724和GRN的在胃癌原代培养的细胞中的表达变化。10.我们用Rg3(50μg/ml)处理胃癌细胞,通过Western Blot检测FUT4. SP1和HSF1的表达。11.我们用Rg3(50μg/ml)处理胃癌细胞,通过流式细胞术检测FUT4、SP1和HSF1的表达。12.我们用Rg3(50μg/ml)处理胃癌细胞,通过ELISA检测FUT4、SP1和HSF1的表达。13.CCK-8检测细胞增殖的能力。IV.实验结果1. H.pylori和CagA对细胞增殖的影响机制的研究(i)与胃炎,胃溃疡的患者相比,胃癌组织和血清中Cag A、p-EGFR、FUT4和LeY的表达增高。(ii)在胃癌组织和血清中,Cag A与p-EGFR、FUT4和LeY的表达相关。(ⅲ) Cag A促进细胞增殖并且呈剂量依赖性。(ⅳ) Cag A上调PCNA的表达及EGFR、ERK1/2和P38的磷酸化水平。(ⅴ) Cag A上调FUT4的表达并呈剂量依赖性。(ⅵ) Cag A上调LeY、LeB、LeX和sLeX的表达。2.塞来昔布和LeY寡糖抗体抑制细胞增殖的机制的研究(i)与普通胃上皮细胞相比,胃癌细胞增殖能力强。(ii)与胃炎,胃溃疡的患者相比,胃癌组织和血清中H. pylori、COX-2、CA724和GRN的表达上调。(iii)在胃癌中,H. pylori的表达和LeY、COX-2、CA724及GRN的表达相关。(iv)塞来昔布抑制FUT1、FUT4和LeY的表达。(v)LeY调节H. pylori的毒性。(vi)联合使用塞来昔布和LeY寡糖抗体处理细胞,能抑制胃癌细胞的增殖。3.Rg3对胃癌细胞凋亡的作用机制的研究(i)Rg3通过激活caspase-3,-8,-9及PARP的裂解促进胃癌细胞凋亡。(ii)在胃癌细胞中,Rg3下调FUT4的表达。(ⅲ) CagA调节SP1和HSF1的表达。(iv)Rg3调节SP1和HSF1的表达。(v)SP1和HSF1调节FUT4的表达。V.结论1.胃癌中CagA、pEGFR、FUT4和LeY的表达升高；CagA通过EGFR/MAPKs信号通路促进FUT4和LeY的表达。2.LeY抗体增加塞来昔布的抗肿瘤作用；LeY抗体和塞来昔布通过抑制COX-2和LeY的表达及其介导的MAPKs/COX-2信号通路抑制肿瘤细胞的增殖。3.Rg3通过调节SP1和HSF1的表达而下调FUT4的表达,达到治疗肿瘤的效果。4. FUT4/LeY、COX-2/LeY和SP1/HSF1可能是胃癌的潜在治疗靶点。