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动脉粥样硬化(AS)是一种发生在大动脉上的慢性炎症,是冠心病和中风等疾病发生的主要原因。众所周知血管内皮功能紊乱被认为是AS形成的始动环节。由血管内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的一氧化氮(NO)在调节内皮功能中发挥重要作用。内源性NOS抑制物非对称二甲基精氨酸(ADMA)与内皮功能紊乱的发生发展密切相关。ADMA除了抑制NO的合成,还能诱导细胞凋亡,参与炎性反应,促进AS的发生发展。氧化应激可通过降低NO的生物利用度而引起内皮功能紊乱,进而促进AS的发生与发展。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导氧化应激促进内皮功能紊乱,也能诱导ADMA的生成;多种具有抗氧化作用的药物可通过降低ADMA浓度来改善血管内皮功能。骨桥蛋白(OPN)是一种促炎症因子,OPN及其受体粘附分子CD44在AS的发生发展过程中起重要作用。AS患者血浆OPN的浓度显著升高,糖尿病、高血压、高胆固醇血症、细胞因子等致AS的危险因素均可升高OPN的水平。OPN参与炎症反应,损伤内皮细胞、促血管平滑肌细胞增殖,从而促进AS的发生与发展。(口山)酮是普遍存在于植物中的一类多酚类化合物。我们实验室以前的工作证明(口山)酮单体能降低ADMA水平,减轻血管内皮细胞损伤。最近研究证明,ADMA也参与炎症反应,但其机制尚未明了。有文献报道NOS的抑制剂左旋硝基精氨酸(L-NNA)能上调OPN的表达,抗氧化剂能抑制OPN表达的上调。因此我们推测ADMA可通过上调OPN的表达,促进血管炎症反应的发生发展。本研究在实验动物和培养细胞,探讨了ADMA促AS形成与OPN途径的关系;在此基础上,研究3,4,5,6-四羟基(口山)酮的抗AS作用及机制。第一章ADMA促动脉粥样硬化作用及机制研究研究背景NO生物利用度降低所引起的内皮功能紊乱是AS形成早期的重要事件。近年大量的研究表明,内源性NOS抑制物ADMA与AS密切相关。ADMA除了抑制NOS活性阻止NO合成,诱导氧化应激,促进内皮细胞与平滑肌细胞凋亡等作用外,还可参与炎症反应,其机制尚未明了。OPN是一种促炎症细胞因子。OPN及其受体—粘附分子CD44,与AS形成密切相关。研究表明,AS患者血浆中OPN的水平明显升高;OPN缺失小鼠AS形成减缓。文献报道,NOS的抑制剂L-NNA能上调OPN表达。因此,我们推测ADMA引起炎性反应可能涉及OPN-CD44途径。ApoE基因缺陷(ApoE-/-)小鼠是研究AS常用的动物模型。研究报道,ApoE-/-小鼠内源性ADMA水平显著升高。目前缺乏ADMA的抑制剂以确证其促AS作用,因此,本实验在ApoE-/-小鼠,研究了内、外源性ADMA促AS形成及其机制。文献报道,ox-LDL及其主要成分溶血性磷脂酰胆碱(LPC)均能诱导ADMA的生成,损伤内皮细胞。我们在培养的内皮细胞,进一步观察内、外源性ADMA对OPN及其受体CD44表达的影响。方法1动物实验实验分设4组(n=10):野生型C57BL/6J小鼠组(C57BL/6J);野生型C57BL/6J小鼠加外源性ADMA处理组(C57BL/6J+ADMA);ApoE基因缺陷小鼠组(ApoE-/-组);ApoE基因缺陷小鼠加外源性ADMA处理组(ApoE-/-+ADMA组)。ADMA处理组每日皮下(S.C.)注射ADMA5mg/kg,共4周,其他组每日S.C.注射等量生理盐水。4周后,颈动脉取血,离心分离血浆,检测血浆ADMA(HPLC法)浓度;开胸,迅速分离主动脉,观察动脉粥样损伤(苏丹红染色法)及主动脉内皮OPNmRNA和蛋白表达(RT-PCR法和免疫组化法)。2细胞实验(1)LPC对内皮细胞的影响将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分为:空白对照组,用DMEM培养液孵育内皮细胞24h;不同浓度LPC处理组,加入终浓度分别为1,3,10μg/ml的LPC孵育内皮细胞24h。检测内皮细胞培养液中OPN(ELISA法)和ADMA(HPLC法)浓度,内皮细胞内ROS水平(荧光法),内皮细胞OPN mRNA(RT-PCR法),OPN蛋白(Western-blot法)和粘附分子CD44 mRNA(RT-PCR法)表达。(2)ADMA对内皮细胞的影响量效实验分组:空白对照组,用DMEM培养液孵育内皮细胞24h;不同浓度ADMA处理组,加入终浓度分别为0.3,1,3,10,30μM的ADMA孵育内皮细胞24h,选择ADMA的最佳剂量;时效实验分组:空白对照组,用DMEM培养液孵育内皮细胞24h;加入终浓度为30μM的ADMA分别处理内皮细胞12h,24h,48h,选择ADMA的最佳处理时间。检测细胞培养液OPN浓度(ELISA法)及内皮细胞OPN mRNA和蛋白(分别用RT-PCR法和Western-blot法)和粘附分子CD44 mRNA(RT-PCR法)表达。结果1动物实验ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块明显,同时伴有血浆ADMA水平升高;给予外源性ADMA(5 mg/kg,4w)可进一步升高ApoE-/-小鼠及C57BL/6J小鼠血浆ADMA水平,同时显著增加ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块面积及促进C57BL/6J小鼠动脉粥样损伤的形成;ApoE-/-小鼠主动脉内皮OPN mRNA和蛋白表达显著升高;同时,外源性ADMA可以显著上调C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠主动脉内皮OPN mRNA和蛋白表达。2细胞实验(1)LPC对内皮细胞的影响10μg/mL LPC孵育内皮细胞24 h,可显著升高ROS,OPN及ADMA水平;上调OPN mRNA,OPN蛋白和CD44 mRNA表达。(2)ADMA对内皮细胞的影响30μM ADMA在培养的内皮细胞24h,可显著增加细胞培养液中OPN的水平,上调内皮细胞OPN和CD44 mRNA表达。结论ADMA是AS形成的重要促进物,其作用可能涉及与OPN-CD44途径。第二章(口山)酮抗动脉粥样硬化作用及机制研究研究背景大量研究表明,AS等多种心血管疾病内皮功能不全与ADMA水平升高有关。低密度脂蛋白(LDL)及ox-LDL是AS时ADMA浓度升高的主要原因。以前的研究证明多种药物可通过降低ADMA浓度而改善血管内皮功能。OPN是近年发现的与AS形成密切相关的促炎细胞因子。核因子-κB(NFκB)是炎症反应中的一个关键调控分子。研究表明,OPN和ADMA均可增加NF-κB活性。而本论文前章结果显示,内外源性ADMA可显著上调内皮细胞OPN表达。(口山)酮是普遍存在于植物中的一类多酚类化合物,具有强效的抗氧化、抗炎及保护血管内皮作用。我们实验室以前的工作证明(口山)酮单体明显减轻ox-LDL及LPC诱导的血管内皮细胞损伤,其作用与降低ADMA水平有关。3,4,5,6-四羟基(口山)酮是我院药物化学系合成的新型(口山)酮单体化合物。基于ADMA能诱导氧化应激上调OPN表达与抗氧化剂能抑制OPN表达,以及(口山)酮具有抗氧特性,本实验在ApoE-/-小鼠和培养的内皮细胞,研究了(口山)酮对AS的防治作用及其机制。方法1动物实验实验分4组(n=20):①野生型C57BL/6J小鼠组;②ApoE-/-小鼠组;③低剂量(口山)酮组,ApoE-/-小鼠给予10 mg/kg(口山)酮处理;④高剂量(口山)酮组,ApoE-/-小鼠给予20 mg/kg(口山)酮处理。3,4,5,6-四羟基(口山)酮每日灌胃给药。4周后,颈动脉取血,分离血浆,检测血浆ADMA(HPLC法)浓度;分离主动脉,检测内皮功能,动脉粥样损伤(苏丹红染色法),主动脉二甲基精氨酸—二甲胺水解酶(DDAH)ⅡmRNA表达(RT-PCR法),DDAH的活性及OPN mRNA和蛋白表达(分别用RT-PCR法和免疫组化法)。2细胞实验(1)(口山)酮对LPC所致内皮细胞损伤的影响实验分组:空白对照组;LPC处理组:LPC(10μg/ml)孵育内皮细胞24h;LPC+不同剂量3,4,5,6-四羟基(口山)酮处理组,加入终浓度分别为1,3,10μM(口山)酮孵育30 min后,再加入LPC(10μg/ml)孵育24 h;检测细胞上清液ADMA(HPLC法),OPN(ELISA法),内皮细胞内ROS水平(荧光法),内皮细胞OPN mRNA和蛋白(RT-PCR法和Western blot法)和粘附分子CD44 mRNA表达(RT-PCR法)。(2)(口山)酮对ADMA所致内皮细胞损伤的影响实验分组:空白对照组;ADM处理组:ADMA(30μM)孵育内皮细胞24 h;ADMA+不同剂量3,4,5,6-四羟基(口山)酮处理组,加入终浓度分别为1,3,10μM(口山)酮30 min后,再加入ADMA(30μM)孵育24 h;检测细胞上清液OPN(ELISA法)水平,内皮细胞OPN mRNA及蛋白表达(RT-PCR法和Western-blot法),内皮细胞核因子-κB(NF-κB)活性(凝胶电泳迁移率,EMSA法)。结果1动物实验3,4,5,6-四羟基(口山)酮可以显著降低斑块面积,显著改善内皮功能,降低血浆ADMA水平,抑制OPN表达的上调,增加主动脉DDAHⅡmRNA表达和DDAH活性。2细胞实验(1)(口山)酮对LPC所致内皮细胞损伤的影响在培养的内皮细胞,(口山)酮可显著抑制LPC诱导的ROS,OPN及ADMA水平的升高;OPN mRNA和CD44 mRNA表达的上调。(2)(口山)酮对ADMA所致内皮细胞损伤的影响在培养的内皮细胞,(口山)酮可显著抑制ADMA诱导的OPN水平升高,OPN表达和NF-κB活性上调。结论3,4,5,6-四羟基(口山)酮对血管内皮具有保护作用,其机制与降低ADMA水平,抑制OPN的表达上调有关。