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鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种隶属于黄杆菌科﹑无运动性﹑不形成芽孢的革兰氏阴性菌,可引起鸭、火鸡和其它多种鸟类的败血性感染。目前已有多种类型的疫苗用于该病的控制,其中包括灭活苗、弱毒苗和亚单位疫苗等。而从实际应用效果来看,现有的这些疫苗还存在着诸如免疫后抗体水平较低、免疫持续时间较短,免疫水平参差不齐等诸多缺点。另外,RA血清型复杂,国际公认的血清型可多达21种,型间基本无交叉免疫保护,致使本病的抗体监测,免疫预防,诊断甚为困难。国内已先后报道了检测RA血清抗体的琼脂扩散试验、玻板凝集试验以及ELISA等,但这些检测方法存在检测灵敏度低、重复性差、只能检测个别血清型等缺点。P25是以RA1的荚膜和外膜抗体从RA1的基因组文库中筛选出的一种反应性蛋白编码基因的ORF全长687 bp,其编码229个氨基酸。BLAST分析表明其与GenBank中收录的AF104 936序列中第1 402～2 088区域核苷酸序列完全一致。以RA1型P25基因设计特异性引物,从1、2、5、8、10等血清型RA中可克隆获得高度相似的ORF序列,编码产物氨基酸序列具有高度同一性。利用在线工具分析了不同血清型P25抗原的潜在抗原区;5种不同血清的抗原区,抗原表位均具有相同的数量。抗原表位基序的Logo分析显示,尽管在不同血清型间具有个别氨基酸(Amino acid, AA)的变异,但未见可能导致抗原决定簇变化的AA(Cys,Leu,Val)出现变异,表明RA的P25与其它细菌外膜蛋白一样,其是不同血清型RA间所共同表达的保护性抗原,可用作不同RA血清型感染的诊断抗原。应用常规的分子生物学方法重组表达菌Escherichia coli Rosetta(pET-32a(+)-P25)在0.1 mmol/L IPTG的诱导下达到可溶性的表达,蛋白通过Ni-NTA纯化试剂盒得到高度纯化,纯化效率达90%以上;完全达到建立ELISA和其它诊断所用抗原的要求。重组表达产物的交叉Western blot分析和不同血清型间ELISA检测结果分析,表明P25是各种血清型RA间所共有的一种抗原。以P25基因的重组表达产物为包被抗原,建立了检测鸭疫里默氏菌血清抗体的间接ELISA。建立的ELISA方法经十字交叉滴定试验其最适抗原包被浓度为0.6μg/mL,血清最佳稀释度为1?64;该试验特异性强,与鸭源大肠埃希菌、鸭源多杀性巴氏杆菌感染鸭血清无交叉反应。20世纪80年代发展起来的胶体金免疫层析技术(gold immunochromatographic assay , GICA)具有成本低廉、操作简便、易于检测大量样本等优点。为了克服传统诊断方法的不足,本研究利用重组表达蛋白P25;作为捕获试剂,并且用胶体金标记P25,建立了一种快速、特异的检测鸭疫里默氏菌血清抗体的双抗原夹心胶体金免疫层析法。通过临床样品不同方法的比较,验证了该试纸条的灵敏度较低,需要进一步优化条件提高灵敏度,以便在生产中对具有保护水平的抗体进行评估。