【摘 要】
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链球菌蛋白G(Streptococcal Protein G,SPG)分子C末端具有IgG抗体结合活性;纤维结合结构域(Cellulose Binding Domain,CBD)是纤维素酶的重要组成部分,不具有降解纤维素功能,但能够通过自身的楔形结构,吸附于纤维素链状分子表面。本课题试图将SPG基因重组于CBD基因3’末端,并通过原核表达获得一种兼具IgG结合和纤维素吸附的双功能融合蛋白,为制备新
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链球菌蛋白G(Streptococcal Protein G,SPG)分子C末端具有IgG抗体结合活性;纤维结合结构域(Cellulose Binding Domain,CBD)是纤维素酶的重要组成部分,不具有降解纤维素功能,但能够通过自身的楔形结构,吸附于纤维素链状分子表面。本课题试图将SPG基因重组于CBD基因3’末端,并通过原核表达获得一种兼具IgG结合和纤维素吸附的双功能融合蛋白,为制备新型IgG亲和层析材料提供一种新的工具蛋白。 本研究利用基因重组技术将嗜纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)的纤维素结合域编码基因CBDclos与绿色木霉(Trichodermaviride)纤维素结合域编码基因CBDtri分别插入出发质粒pET28a-SPG中,获得表达质粒pET28a-CBDclos-SPG与pET28a-CBDtri-SPG。质粒验证无误后,经热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)。用含有卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性重组子,并且在卡那霉素选择压力下能够稳定传代。用LB液体培养基培养工程菌,生长至OD600为1时,以IPTG为诱导剂,30℃条件下诱导目的基因表达,获得融合蛋白CBDclos-SPG、CBDtri-CBD,分子量分别为40kDa、30kDa。对表达产物两部分结构的功能进行鉴定,并选用纤维素Sigmacell50装柱,对目的蛋白进行分离纯化。获得纯品后,对蛋白与不同材料和IgG的结合能力进行测定。结果显示不同多糖材料对CBDclos-SPG的载量明显高于CBDtri-CBD,其中纤维素Avicelph101对CBDclos-SPG的载量可达11.61mg/g,Avicel ph101-CBDclos-SPG对兔IgG的载量可达25.73mg/g。 此外,本研究还对CBDclos-SPG进行应用探索,将蛋白吸附于纤维素表面,形成纤维素-CBDclos-SPG复合物,进行兔血清中IgG的分离纯化和样品中抗原的捕获进行探索。实验结果表明,CBDclos-SPG可结合于纤维素表面,作为配基纯化兔血清中的IgG,也可以与HSA抗体结合,进而捕获生物样品中的融合蛋白IFNβ-HSA。 本课题通过分子设计、构建、表达等步骤获得双功能蛋白CBD-SPG(CBDclos-SPG、CBDtri-CBD)。实验表明,CBD-SPG即具有纤维吸附能力,又具备IgG Fc端结合能力,为免疫学分析提供了一种新型工具蛋白,同时也有望成为一种新型亲和层析材料,可用于IgG分离纯化方面。
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