在1999年9月份,当一个正在通过肝动脉给药,接受高滴度腺病毒载体治疗的病人死于病毒载体所引发的毒性反应后,人们对于腺病毒(Ad)载体用于临床基因治疗的理解发生了转变。当然,在临床治疗中所需的对腺病毒载体的连续性给药可能关系到机体对腺病毒的强烈反应,但是更重要的是,通过研究人们获得了更多的对腺病毒毒性的了解。我们都意识到,没有哪一种载体系统是完美无缺的。在看到腺病毒载体并不适于所有治疗应用的同时,我们也不会因此而忽略腺病毒载体那些相对于其他载体系统的显著优点:能够有效地感染静息或分裂中细胞,这是很多载体无法做到的;腺病毒能够在短时间内实现高水平的基因表达,这对于那些只需要短期高表达转基因就能产生足够治疗效应的应用意义重大。腺病毒载体潜在应用包括治疗性的血管生成作用,能够在中央神经系统(CNS)实施感染,以及在那些腺病毒的毒副作用也能产生帮助的治疗当中如作为肿瘤疫苗。当然毫无疑问的是,为了更广泛地应用腺病毒载体,解决其引起体内免疫应答的问题是当务之急。本次研究集中在腺病毒诱导的肝脏损伤,诱导体内肝脏抗病毒免疫抑制和黑色素瘤基因治疗方面,获得了如下的结果:1、新型高压注射重组腺病毒诱导肝损伤模型的建立目前,腺病毒载体能在肝脏中定位并引起肝脏炎症和损伤的研究甚多,但是通用的动物模型研究并不多。本部分研究的目的就是建立一种新的腺病毒诱导的爆发性肝炎模型,来促进对腺病毒诱导的自身免疫性肝炎的机制研究。我们采用了高压注射(注射体积占体重10%,并在7秒中内完成注射)腺病毒载体的方法,将腺病毒载体快速地特异地通过尾静脉传递到小鼠肝脏内部,观察后继的病毒感染引起的肝脏损伤。C57 BL/6小鼠尾静脉高压注射表达不同产物的腺病毒(AdLacZ,AdEGFP,AdsiNeg),通过流式细胞术分析肝脏内部淋巴细胞的比例和绝对数,血清转氨酶和H&E染色被用作评价肝脏损伤的指标。我们发现,高压注射腺病毒比普通注射诱导更加严重的肝脏炎症:大量的单个核细胞迅速浸润,尤其是肝脏NK细胞显著增加和活化;同时发现血清ALT转氨酶水平大幅升高:肝脏内出现多处坏死;IFN-γ在肝脏中的转录水平及在血清中蛋白水平上升。通过注射抗体预先清除NK细胞,可以显著减轻腺病毒诱导的肝脏损伤以及炎症因子IFN-γ的表达水平。这些数据表明腺病毒感染诱导了肝脏中NK细胞的浸润和活化,从而导致了肝细胞的损伤以及肝脏炎症的产生,NK细胞是该模型中病毒感染引发的早期炎症的主要效应细胞。总的来说,我们的工作展示了一个与人的急性肝脏感染相关的新的病毒肝炎模型,为研究腺病毒提供了一个实用有效的工具和平台。2、治疗性RNA干扰CX3CL1抑制腺病毒引起的肝脏损伤我们研究了趋化因子CX3CL1/fractalkine(FKN)在抗病毒感染免疫应答中的作用。FKN是一种CX3C类的趋化因子,有膜结合型和分泌型两种存在形式。大部分NK细胞,CD14~-单核细胞及部分的CD8~+T细胞表达相应受体CX3CR1。通过进一步研究以上构建的高压注射腺病毒诱导的肝脏损伤模型,我们发现CX3CL1在腺病毒感染的肝脏中是显著上调的,并且有意思的是同时发现浸润到炎症肝脏中的主要效应细胞NK细胞上相应受体的CX3CR1表达也显著上调。为了进一步证明二者关系,我们构建了表达重组小鼠CX3CL1的腺病毒进行注射,发现在肝脏内过表达CX3CL1大大增加了CX3CR1~+NK细胞的浸润和活化水平,血清中ALT转氨酶的水平及肝脏坏死程度也大幅升高。这表明腺病毒感染肝脏后诱导肝脏内CX3CL1的表达增加,CX3CL1与其受体CX3CR1相互作用在NK细胞的招募和活化以及IFN-γ的产生中行使重要的作用。因此,抑制CX3CL1的表达将可作为抗腺病毒炎症治疗的一个选择。实验中,运用高压注射表达CX3CL1特异性干扰小RNA的腺病毒进行了体内RNA干扰,发现病毒感染后CX3CL1在肝脏中的表达水平被明显抑制,相应地,NK细胞的浸润及肝脏损伤和炎症也显著下调。为了更好地验证CX3CL1的促炎症作用,我们在注射腺病毒之前用CX3CL1或CX3CR1的阻断抗体预先处理小鼠,结果显示肝脏中的炎症损伤及淋巴细胞浸润也能被很好地抑制。综上,该实验证明了CX3CL1-CX3CR1趋化因子系统在腺病毒诱导的肝脏损伤中的促炎症功能和重要性,并为体内基因治疗提供了一个新的靶点和手段。3、RNA干扰CX3CL1抑制黑色素瘤体内生长及机制研究虽然有报道称过表达的CX3CL1促进对肿瘤细胞的杀伤,CX3CL1行使的是抑制肿瘤生长的作用。而我们的研究经RT-PCR,Western Blotting以及免疫荧光检测发现小鼠黑色素瘤B16-F0细胞及一些肿瘤病人的实体瘤表达CX3CL1。进一步的流式细胞术抗体检测发现B16上CX3CL1为阳性,而ELISA检测发现B16的培养上清中无可溶性FKN的表达,这证明了B16表达的CX3CL1为膜结合型。因此我们猜测这种膜结合型的CX3CL1可能参与了肿瘤的发生过程。运用表达CX3CL1特异性干扰小RNA的腺病毒感染B16-F0黑色素瘤细胞,沉默了B16细胞上CX3CL1的表达。通过流式细胞分选技术筛选得到CX3CL1表达被有效抑制的B16细胞。在C57 BL/6小鼠上进行体内荷瘤的结果发现CX3CL1敲除鼠与对照组相比肿瘤的成瘤性大幅降低;生存曲线数据表明CX3CL1敲除组的小鼠的生存情况要显著优于对照组。对肿瘤切片加以研究发现,血管内皮细胞表达CX3CL1的受体CX3CR1;CX3CL1敲除组的肿瘤生长受到严重抑制且瘤体内部和周围只有少量的血管生成,而对照组肿瘤生长旺盛,并伴随着大量的肿瘤内血管分布。因此我们有理由认为肿瘤表达一定水平的CX3CL1来促进它们自身与体内表达CX3CR1的血管内皮细胞相互作用,加强肿瘤发生过程中对血管内皮的黏附及促肿瘤内部血管生成,从而促进了肿瘤的发生。