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目的建立羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin, HCPT)诱导的肝癌SMMC-7721细胞线粒体凋亡模型,运用比较蛋白质组学分析鉴定线粒体凋亡前后的差异表达蛋白质,为从亚细胞器蛋白质水平进一步阐明HCPT诱导肝癌细胞发生凋亡的机理奠定基础;并对其中筛选出的差异蛋白—凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)进行功能研究。策略与方法1.确定线粒体凋亡时相:用HCPT处理肝癌SMMC-7721细胞,通过光镜、MTT实验、电镜、流式细胞仪和AO/EB双染等方法分别在定性、定量、早期与晚期等不同层面上检测HPCT的致肿瘤细胞凋亡活性;通过线粒体跨膜电位、激光共聚焦与western blot法等检测线粒体凋亡的时相变化,并确定线粒体凋亡时相。2.线粒体纯度鉴定:用线粒体组分分离试剂盒分离肝癌SMMC-7721细胞线粒体,用詹纳斯绿B染料对分离的线粒体进行染色鉴定;分别用核蛋白Histone、细胞骨架蛋白β-actin、溶酶体蛋白Cathepsin-D和热休克蛋白HSP60作为细胞核、细胞浆、溶酶体和线粒体的特异标志蛋白,用western blot对分离的线粒体进行纯度鉴定。3.运用比较蛋白质组分析线粒体凋亡前后的差异表达蛋白谱:通过优化各种条件参数来确定合适的样品上样量、染色方法与胶条种类。按蛋白质溶解度不同将线粒体蛋白分成三个组分,对三个组份分别进行双向电泳分离。用PDquest(7.0)软件对扫描的二维凝胶电泳图像进行分析,筛选出线粒体凋亡前后的差异表达蛋白斑点。候选差异表达蛋白斑点经胶内胰酶酶解,MALDI-TOF-MS分析,得到肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF),使用Mascot软件在MSDB数据库中检索鉴定差异表达蛋白质,并对差异蛋白质进行生物信息学分析。4. AIF是筛选出的差异表达蛋白之一,探究在HCPT致细胞凋亡的过程中,AIF凋亡途径是否参与其中:在用HCPT处理SMMC-7721细胞后,分别用RT-PCR、western blot法检测AIF在mRNA与蛋白质表达水平的变化;用激光共聚焦与western blot法等检测AIF发生亚细胞器转位的时相变化;用DNA ladder试验检测DNA损伤情况。5. AIF相互作用蛋白质的筛选:RT-PCR扩增剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段并克隆入pcDNA3.1载体,导入肝癌SMMC-7721细胞后分别通过RT-PCR、western blot法检测AIF在转录与翻译水平上的表达情况。提取转染外源AIF的细胞与对照细胞中的蛋白质,用免疫沉淀方法分离与AIF可能存在相互作用的蛋白质:用MALDI-TOF-MS对分离得到的蛋白质进行鉴定;再次用免疫共沉淀法与western blot法对筛选出的可能相互作用蛋白质进行验证。6. AIF蛋白的原核表达、纯化及生物学活性分析:通过次序严密的分步克隆,将AIF基因片段亚克隆入原核表达载体pET32a(+)中。进行酶切与测序鉴定后,以构建正确的重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达重组AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和western blot进行鉴定;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后试验与Hoechst染色检测重组蛋白AIF的生物学活性。结果1. HCPT对肝癌SMMC-7721细胞的增殖有明显抑制作用,半数抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC50)约是80μg/ml。当用80μg/ml HCPT对细胞处理不同时间后,细胞可发生一系列形态学变化:细胞膜的磷脂酰丝氨酸外翻,细胞核染色质固缩,呈致密浓染的凋亡状态;超微结构观察发现线粒体出现了肿胀性变化,线粒体跨膜电位下降并伴随有CytC从线粒体至细胞浆的释放。2.分离的线粒体经詹纳斯绿B染色后,呈蓝绿色的颗粒状或棒状结构; western blot结果表明:提取的线粒体组分检测到了线粒体标志蛋白HSP60,而检测不到细胞核标志蛋白Histone、细胞浆标志蛋白β-actin与溶酶体标志蛋白Cathepsin-D。3.通过优化条件,最终确定合适的样品上样量为200μg、最佳染色方法为银染、最佳胶条为非线性pH3～l0胶条。通过对线粒体凋亡前后的二维凝胶电泳图像进行对比分析,发现约有39个蛋白斑点表达有差异,对其中25个差异蛋白斑点进行MALDI-TOF-MS分析后,鉴定出了20种可能的差异表达蛋白。4. HCPT处理SMMC-7721细胞后,全细胞中AIF在mRNA与总蛋白质表达水平上无变化。激光共聚焦及亚细胞器水平上的western blot检测结果均表明:HCPT处理细胞后,AIF从线粒体释放并迁移至细胞核。伴随AIF的核迁移,核DNA出现了损伤。5.转染的外源AIF基因,可在肝癌SMMC-7721细胞中成功表达。用免疫沉淀方法在转染AIF的细胞中分离到了8个蛋白条带,在对照细胞中分离到了7个与转染组相同的蛋白条带,并对其中一蛋白条带进行了鉴定,此蛋白为β-actin。6.人AIF基因能在PET表达系统中成功表达;纯化的重组蛋白AIF与DNA能有效在体外结合;重组蛋白AIF可诱导细胞核发生凋亡。结论1. HCPT可通过Cytc依赖的线粒体途径诱导细胞发生凋亡。2.线粒体纯度鉴定试验说明:提取的细胞器组份是线粒体并且线粒体纯度较高,可用于下游的蛋白质组分析。3.鉴定出的20种差异表达蛋白可能在HCPT诱导的线粒体凋亡途径中起重要作用。4. HCPT可通过AIF依赖的线粒体途径诱导细胞发生凋亡。5.β-actin可能与AIF存在相互作用。6. AIF基因能在PET表达系统中表达,重组蛋白AIF具有良好的生物学活性,为下一步能更好地研究AIF的功能奠定了基础。