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已有研究表明缺血损伤脑内新生神经元可以分化成熟并且与原有的神经元建立起经典的突触联系,功能性地整合到原有的神经环路中。缺血诱导的新生神经元是否能与其他脑区建立起联系,对缺血后运动功能的恢复具有重要意义。因此,本文着重探讨缺血损脑内新生神经元是否能够形成长投射到黑质网状部。采用短暂性大脑中动脉栓塞建立局部脑缺血动物模型。通过BrdU(5’-bromodeoxyuridine)腹腔注射和绿色荧光蛋白(GFP)标记的逆转录病毒侧脑室注射两种方式标记脑内的新生神经元,荧光金(FG)微量注射到黑质网状部逆向示踪皮层及纹状体内具有长投射功能的神经元。采用免疫荧光多标记结合激光共聚焦扫描技术,观察缺血损伤脑内新生神经元投射的形成情况。研究结果发现,在缺血再灌注第12周缺血侧纹状体内有BrdU+-NeuN+-FG+三标的阳性细胞存在,而这种三标细胞在缺血再灌注第2周及第9周并没有被观察到。同时,在缺血再灌注第13周,缺血侧纹状体及皮层均观察到GFP+-NeuN+-FG+三标的阳性细胞。实验结果表明,缺血诱导的纹状体及皮层的新生神经元可以形成长投射到黑质网状部,并且这种新生的投射具有完整的轴浆转运功能。此外,在缺血再灌注第13周,缺血侧纹状体内观察到GFP+-NR2+及GFP+-D2L+双标的阳性细胞。说明纹状体新生神经元具有接受来自皮层谷氨酸能及黑质多巴胺能神经元信息传入的功能。运动康复训练是目前临床上促进脑卒中患者后期功能恢复的有效方法之一,康复训练可明显促进脑卒中患者的神经功能及提高运动功能恢复。研究认为,缺血后的运动训练不仅能促进缺血损伤脑内的神经发生,同时可以通过调节神经生长因子的表达进而影响神经突触的可塑性。为了进一步研究缺血后运动训练对新生投射神经元轴突再生的影响,在缺血再灌注第5-28天给予动物一定强度的运动训练,在再灌注不同时间点采用Rota-rod方法检测动物运动功能的恢复情况。通过Western blot方法检测脑内轴突生长相关蛋白表达的变化。结果显示,运动训练能明显上调BDNF、VEGF及synapsin的蛋白表达。通过免疫组化双标记结合立体计数方法,观察运动训练对缺血损伤脑内新生投射神经元数量的影响。结果显示,缺血后运动训练明显增加纹状体及皮层GFP+-FG+双标细胞数目,即促进缺血脑内新生神经元形成长投射到黑质网状部。为了进一步研究缺血损伤对远距离靶区黑质内多巴胺能神经元的影响,我们采用免疫组化标记多巴胺能神经元特异性标记物络氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)并结合立体计数的方法。结果显示,缺血损伤会引起远距离靶区黑质内多巴胺能神经元的丢失。而缺血后的运动康复训练,明显抑制了缺血损伤对黑质内多巴胺能神经元的影响。行为学结果显示,缺血后运动训练明显提高了动物运动功能的恢复。以上结果表明,缺血后运动训练明显提高新生投射神经元的轴突再生能力并且促进运动功能的恢复。为解释临床中卒中患者康复训练的有效治疗提供了重要的科学依据。DNA甲基化作为表观遗传修饰的一个重要方式在调节神经干细胞的自我增殖及其分化过程中发挥着重要作用。本文主要研究在成年大鼠脑内DNA甲基转移酶(DNMT1)对缺血诱导的神经新生的影响。结果显示,缺血损伤对纹状体内DNMT1的蛋白表达并没有明显的影响,但引起缺血周边区中DNMT1在星形胶质细胞上表达,同时伴随着5-甲基化胞嘧啶(5’-meC)表达的增加。为了进一步探讨DNMT1在缺血诱导的神经新生中的作用,我们选择特异性DNMT1抑制剂,5-氮杂-2’-脱氧胞苷(AZA),降低脑内DNMT1酶活性。结果显示,AZA明显增加缺血损伤脑内BrdU+-DCX+神经前体细胞的数量,及上调神经分化相关转录因子Pax6和Olig2的蛋白表达。此外,AZA明显减小脑梗塞体积和降低神经元退行性病变的发生。以上结果提示,DNA甲基转移酶抑制剂有利于缺血损伤脑内神经元新生,从而促进缺血损伤后脑的修复。该研究发现为缺血性脑卒中的治疗提供了新的分子靶点。结论:缺血诱导纹状体及皮层新生神经元形成长投射到黑质网状部。缺血后运动训练有效地提高脑内新生投射神经元的轴突再生能力,并促进运动功能的恢复。缺血损伤引起纹状体内DNMT1表达的改变,抑制DNMT1活性使神经干细胞分化转录因子上调促进神经元的新生,并减轻缺血性脑损伤程度。本文结果提示,促进损伤脑内神经元新生及其神经环路的重建有利于脑功能的重构。