华支睾吸虫病(clonorchiasis)又称肝吸虫病，是我国常见的食源性寄生虫病，流行于25个省市、自治区，以广东省流行最为严重。全国现有肝吸虫感染者1249万，其中广东省占500多万。广东省有81个县市流行肝吸虫病，珠江三角洲地区流行最为严重，个别地区人群感染率高达85﹪。华支睾吸虫成虫可长期寄生于人的肝胆管内，对肝胆系统造成慢性损伤，引起胆管局限性扩张、胆管炎、胆管上皮细胞腺瘤样增生、肝硬化甚至诱发肝胆管肿瘤，是广东省重点防治的地方病之一。作为我国最重要的食源性寄生虫病，引起了国家的高度重视，被列为国家重点防治的目标疾病之一。 华支睾吸虫病的正确诊断是防治的关键。目前华支睾吸虫病的诊断主要依靠病原学检查和免疫学检测。传统的病原学方法是镜检粪便中的虫卵，由于华支睾吸虫排卵具有周期性且虫卵很小，容易漏诊，且操作费时费力，不适合大规模的流行病学调查。免疫学诊断方法具有高度的敏感性和特异性，是病原学诊断的重要补充，在临床辅助诊断和流行病学调查中发挥了越来越重要的作用。 目前，常用的免疫学诊断方法有酶联免疫吸附试验(E L I S A)，间接血凝试验(I H A)，间接荧光抗体试验(I F A T)，免疫酶染色技术(I E S T)，皮内试验(I D T)等。ELISA方法具有高度的敏感性和特异性，操作简便，无需特殊仪器设备，血样用量少，结果容易判断，适合现场应用，是目前流行病调查和临床诊断中应用最为广泛的免疫诊断方法。目前用于华支睾吸虫病诊断的ELISA检测试剂盒是用成虫粗抗原检测血清中总IgG，假阴性和假阳性率都比较高，且存在诊断抗原的来源困难和难以标准化的问题。因此，应用成分明确的重组抗原替代粗抗原是免疫诊断试剂盒研制的必然趋势，关于华支睾吸虫免疫诊断抗原的筛选和评价是国内外华支睾吸虫病研究的重点，也是本实验室近年来华支睾吸虫研究的主要目标之一。本实验室通过华支睾吸虫成虫的功能基因组学研究，鉴定和克隆表达了一批华支睾吸虫的重组抗原。这些重组抗原的制备为研制华支睾吸虫病的免疫诊断试剂盒奠定了良好的基础。 研究目的 本研究是对本实验室已表达但没有进行免疫诊断价值评价的6种华支睾吸虫重组蛋白，通过间接ELISA方法检测从华支睾吸虫病流行区的感染血清、正常血清和非流行区的正常血清中的总IgG或IgG<,4>亚类(IgG<,4>一般属于短程抗体，驱虫后转阴时间短，被认为具有疗效考核价值)，评价其敏感性、特异性，从中筛选出能检测某种特异性抗体类型或亚类并具有理想的敏感性、特异性和分辨率的一种或多种抗原，研制一种操作简便，肉眼可直接判断结果的适合现场使用的ELISA筛查试剂盒和疗效考核试剂盒，为我国华支睾吸虫病的流行病调查、防治效果的评价提供一种简便、快捷、准确的血清学方法。 研究方法 1 华支睾吸虫成虫6种重组抗原的表达、纯化华支睾吸虫成虫谷胱甘肽转移酶1(GST1)、谷胱甘肽转移酶2(GST2)、翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)、乳酸脱氢酶(LDH)、表膜蛋白(TP)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)6种重组蛋白的重组载体由本室保存。分别将六种重组质粒转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达，根据其携带的GST或His标签，采用相应的亲和层析方法获得纯化重组蛋白，含有GST标签的重组蛋白用凝血酶切除GST，获得纯化的重组蛋白。 2 间接ELISA法评价六种候选抗原检测特异性的总。IgG或IgG4亚类的敏感性和特异性 2．1 间接ELISA法检测华支睾吸虫病流行区人群血清中的特异性总IgG获得纯化的重组抗原后，以此作为包被抗原用间接ELISA法检测血清中特异性的IgG。以GST2为代表，采用方阵法滴定抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度、酶标二抗最佳稀释倍数。对6种抗原检测病人血清中的总的IgG进行初步筛选，筛选出一种或几种特异性和敏感性都比较好的抗原。 2．2 间接ELISA法检测华支睾吸虫病流行区人群血清中的IgG<,4>亚类在2．1 筛选的基础上，检测病人和正常人血清中的IgG<,4>，评价其敏感性、特异性，从而找出最佳的诊断抗原和最佳的酶标二抗。 2．3 间接ELISA诊断方法的建立及试剂盒的生产工艺标准和标准化操作流程的制定用筛选出来的重组蛋白作为诊断抗原包被ELISA反应板，试验确定最适抗原包被浓度、最适封闭液、最适血清稀释度及工作时间、最适酶标抗体稀释度及作用时间、最适底物显色时间和间接ELISA判定标准，建立检测华支睾吸虫病人血清抗体的间接ELISA诊断方法。通过特异性试验、敏感性试、重复性试验、稳定性实验和现场试验确定试剂盒的生产的工艺标准和操作标准。完成标准化的免疫诊断试剂盒的研制。 研究结果 1 六种候选抗原的表达纯化按照本实验室已经确定的6种重组表达抗原的表达条件，6种重组质粒在IPTG诱导下成功表达出重组融合蛋白，经SDS-PAGE显示与理论预测的融合蛋白分子量相符。其中CsTP和血吸虫GST的融合蛋白进行亲和层析纯化和酶切，获得的纯化CsTP蛋白经SDS-PAGE鉴定分子量与理论预测值相符。 2 6种重组抗原初步建立间接ELISA法，检测华支睾吸虫病流行区人群血清中总IgG以GST2为代表，建立间接ELISA方法，确定其最佳的反应条件，其他5种蛋白初步按照GST2确定的条件，对6种蛋白的诊断价值进行初步评价。筛选出比较理想的诊断抗原是GST2。 3 GST2作为诊断抗原检测不同人群血清中的IgG<,4>亚类用重组抗原GST2检测血清中特异的IgG<,4>，确定最佳的反应条件，检测华支睾吸虫病流行区和非流行区感染血清和正常血清特异性IgG<,4>。血清做1：5稀释后，流行区人群阴性血清的平均OD值为0.038，阳性血清的平均OD值为0.602，阴性和阳性检测结果差异非常显著，肉眼观察可以准确判断结果。其敏感性可达87.1﹪，特异性在95﹪以上，并与其他肠道寄生虫感染血清进行交叉反应，发现其与蛔虫、钩虫、鞭虫、肺吸虫、囊虫血清、裂头蚴、弓形虫等均有不同程度的交叉，尤其与肺吸虫交叉反应率高达75﹪。 4 间接ELISA试剂盒最佳反应条件的确定用方阵滴定GST2的最佳包被浓度为10 μ g/ml，血清最佳稀释度为1：5及最佳反应条件为37℃1h；最佳封闭条件为5﹪脱脂奶粉37℃2h；酶标二抗最佳稀释度及最佳反应条件为1：1，000，37℃1h；显色液室温显色5min左右，2mol/LH<,2>SO<,4>50 μ 1终止反应。基本完成了华支睾吸虫病ELISA诊断试剂盒的生产工艺研究和实验室评价。 研究结论 1 成功表达出六种重组融合蛋白，并获得足量的纯化重组蛋白。 2 六种重组蛋白检测病人血清中的总IgG，GST2效果最好，但敏感性和特异性仍不甚理想。 3 GST2作为诊断抗原，检测特异性IgG<,4>，阴性结果和阳性结果差异显著，敏感性达87.1﹪，特异性达95﹪以上。 4 确定间接ELISA试剂盒的最佳反应条件为：抗原最佳包被浓度为10 μ g/ml；血清最佳稀释度及最佳反应条件为为1：5，37℃1 h；最佳封闭条件为5﹪脱脂奶粉37℃2h；酶标二抗最佳稀释度及最佳反应条件为1：1，000，37℃1 h；显色液室温显色5min左右终止反应，读数。基本完成了试剂盒的研制和实验室评价。 5 关于本试剂盒的疗效考核的评价尚需对流行区华支睾吸虫病人进行治疗后的跟踪随访和检验来进一步获得实验数据进行分析。