研究背景复杂型先心病大部分为紫绀型先心病,是婴幼儿最常见的先天性畸形,主要由心脏任何水平的右向左分流引起的,慢性缺氧是其共同的病理生理过程。长期的临床研究发现,虽然紫绀型先心病患者的心脏被低氧血液长期灌注,但是仍可以抵御心脏外科手术所致的缺血缺氧,且很少发生心力衰竭,提示慢性缺氧可诱导心脏产生代偿性的适应,而这种变化将会对心肌细胞产生保护作用。因此,深入探讨心肌细胞在慢性缺氧条件下的代偿机制,将有助于改进心肌保护策略,提高先心病的临床诊治水平。MicroRNAs (miRNAs)是一种进化上高度保守的短链非编码RNA,可诱导靶基因mRNA降解以及翻译抑制,进而发挥调控蛋白表达的功能。在心肌细胞中,多种miRNAs被报道参与了心肌病理生理过程,并且与慢性缺氧保护密切相关cmiRNA-138(miR-138)是最近研究的较为热门的miRNA之一。在心脏发育中,miR-138起到了关键性调控作用。一旦miR-138表达降低,将会出现不同程度的心室肌形态异常以及心脏功能受损。同时,miR-138还被发现与缺氧相关。缺氧可诱导miR-138表达上调,而这种改变能够促进缺氧细胞的增殖,提示miR-138可能在缺氧条件下发挥着一种代偿性的保护作用,而其分子机制还需进一步研究。C-jun氨基末端激酶(c-jun N terminal kinase, JNK)信号通路是丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)中关键的通路之一,在心肌细胞的凋亡调控中发挥重要的作用。混合谱系激酶3 (Mixed Lineage Kinase 3, MLK3)是JNK的上游激酶,其能够诱导JNK磷酸化,而激活后的JNK可以与c-jun氨基末端区域相互结合,增强转录因子活性,从而促进凋亡相关基因表达以及蛋白合成。MLK3/JNK/c-jun信号通路在慢性缺氧心肌中的作用目前还研究较少,因此深入研究其分子机制及表达调控将会为临床心肌保护提供一个新的靶点。研究目的本项目拟在细胞水平及临床心肌标本中检测慢性缺氧条件下miR-138及MLK3信号通路关键蛋白的表达和蛋白酶活性；通过建立体外慢性缺氧心肌模型,应用agomir及antagomir技术实现miR-138的沉默和过表达,在细胞水平检验miR-138/MLK3/JNK/c-jun信号通路的调控作用,双荧光素酶报告基因证实MLK3为miR-138的靶基因,评价miR-138在慢性缺氧条件下心肌细胞凋亡中的影响；采用shRNA质粒转染的方法沉默MLK3,证实其通过干扰JNK/c-jun信号的激活,参与了心肌慢性缺氧适应。研究方法1.慢性缺氧模型的建立,及人心肌标本的采集：1.1体外培养H9C2心肌细胞株,无血清培养基饥饿过夜后,置于1.0% 02、5.0%CO2孵箱中培养12h、24h、48h及72h,建立慢性缺氧细胞模型；1.2缺氧心室肌标本取自于紫绀型先心病病人(如法洛四联症),对照组取非紫绀型先心病病人(如室间隔缺损合并右室流出道狭窄),于手术中取得标本后迅速置于液氮中保存。2.检测miR-138、MLK3的表达：2.1采用qRT-PCR、Western blot技术检测miR-138、MLK3在缺氧细胞及人心肌标本中表达情况；2.2利用免疫组化技术定位MLK3的表达。3.研究miR-138在心肌慢性缺氧中的保护作用：3.1采用agomir及antagomir转染的方法,以稳定沉默和过表达miR-138,RT-PCR验证转染效率；3.2用流式细胞仪、TUNEL、Western Blot检测凋亡相关蛋白活性等方法,研究miR-138干扰后的H9C2细胞在慢性缺氧时的凋亡；显微镜下观察细胞的形态；Western Blot检测MLK3蛋白表达水平的变化；3.3构建双荧光素酶报告基因,证实miR-138直接靶向调控MLK3；采用Western-bolt方法,在miR-138干扰的心肌中检测MLK3、JNK、c-jun等MAPK中关键蛋白的表达及磷酸化。4.研究MLK3在心肌慢性缺氧中的作用：4.1构建MLK3的shRNA质粒,转染H9C2细胞以沉默MLK3, RT-PCR、Western Blot验证转染效率；4.2绘制稳定沉默MLK3的H9C2细胞在慢性缺氧时的生长曲线; LDH、TUNEL、台盼蓝染色等方法检测心肌细胞的凋亡及活性；Western blot方法检测凋亡相关的蛋白表达；4.3采用Western-bolt技术,在MLK3干扰的心肌中检测JNK、c-jun等MAPK中关键蛋白的表达及磷酸化。实验结果1.术中提取心肌标本后,qRT-PCR结果显示紫绀组患者心肌中miR-138的表达量显著高于非紫绀组患者。将H9C2心肌细胞株置于缺氧孵箱中分别培养12h、24h、48h、72h后,提取细胞总RNA进行qRT-PCR,结果显示随着缺氧时间延长,miR-138的表达量逐渐增加。2.与对应的NC组进行比较显示,agomir组中miR-138表达量明显上调,而antagomir组则下降。MTT检测细胞在缺氧不同时间点的生长曲线,结果显示agomir组细胞生长率最高,而antagomir组则最低。LDH检测细胞死亡率,miR-138上调后可显著抑制细胞死亡。利用TUNEL, Hoechst染色及流式细胞仪检测缺氧心肌的凋亡,结果显示与NC组相比,agomir组的凋亡数量明显减少,而在antagomir组中,心肌凋亡数量则是最多的。Western blot方法检测凋亡相关的蛋白表达,结果显示在agomir组中cleaved-caspase 3、cleaved-PARP、Bad的表达显著下调,Bcl-2的表达上调,Bax的表达无明显差异,但是Bcl-2/Bax的比值仍有显著性的降低,而下调miR-138表达后则结果相反。3.构建MLK3 3’UTR区的野生型及突变型质粒,与agomir共转染293T细胞株,采用双荧光素酶报告基因检测,结果显示miR-138转染后可明显降低荧光强度,提示MLK3为miR-138的靶蛋白。在H9C2细胞中干扰miR-138后,MLK3的表达也出现明显的差异性变化。同时,miR-138还能够抑制JNK及c-jun的磷酸化。4.在临床心肌标本中通过Western blot和免疫组化等方法检测MLK3的蛋白表达,结果显示紫绀型患者心肌中MLK3表达明显低于非紫绀组。在缺氧的H9C2细胞中,MLK3的表达也随着缺氧时间延长而逐渐降低。然而,采用qRT-PCR技术检测MLK3的mRNA表达,在人心肌标本以及缺氧H9C2细胞中均无显著性差异。5. MTT、LDH检测及台盼蓝染色结果显示沉默MLK3后能够明显促进缺氧心肌的生长。利用TUNE、Hoechst检测缺氧心肌的凋亡,MLK3 shRNA转染组中凋亡细胞数量显著降低。Western blot方法检测凋亡相关的蛋白表达,结果显示MLK3沉默能够下调cleaved-caspase 3、cleaved-PARP、Bad、Bax的表达,上调Bcl-2的表达。同时,MLK3还能够影响其下游蛋白JNK及c-jun的活化。结论1.紫绀组患者心肌中miR-138表达较非紫绀组明显上调,且在H9C2细胞中,miR-138的表达随着缺氧时间延长而逐渐升高。2.miR-138的上调可显著减轻缺氧所致的心肌凋亡,促进心肌细胞在缺氧环境下生长和存活。3.MLK3为miR-138调控的靶蛋白,干扰miR-138表达后,MLK3/JNK/c-jun通路的激活受到明显影响。4.MLK3的蛋白表达在缺氧心肌中下调,但是其mRNA却无显著变化,提示缺氧对MLK3可能存在的是一种转录后调控的作用。5.抑制MLK3表达后可减轻缺氧所致的心肌凋亡,且其下游蛋白JNK及c-jun的活化也受到明显抑制。