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贾第虫是一种主要寄生于宿主小肠中的寄生虫,可感染包括人在内的多种哺乳动物引起贾第虫病,该病的临床症状一般为腹痛、腹泻、消化不良和体重减轻。所有人都可以成为贾第虫寄生的宿主,其中儿童、免疫缺陷者和年老体弱者的感染几率会更高,对于儿童来说除胃肠道症状外还会造成生长迟缓和智力发育迟缓等问题。目前对于贾第虫的预防和治疗还没有较为有效的药物与方法,所以了解贾第虫的致病机制对于贾第虫病的防治具有重要的作用。有研究发现氧化应激反应与许多疾病的发生相关,对于肠道损伤也具有一定的影响,可能激活肠上皮细胞发生凋亡。本实验旨在探究贾第虫诱导肠上皮细胞凋亡的具体机制,以及活性氧(ROS)在其中的作用。本研究中利用贾第虫滋养体与Caco-2细胞共培养建立贾第虫体外感染细胞模型,在贾第虫滋养体作用于Caco-2细胞不同时间后,通过乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞毒性作用。运用流式细胞仪检测贾第虫滋养体对细胞凋亡和细胞周期的影响,并用普通光学显微镜和透射电子显微镜观测细胞形态的变化。利用流式细胞仪以及荧光显微镜检测贾第虫作用后的细胞内ROS水平的变化,并通过谷胱甘肽还原酶试剂盒测定谷胱甘肽(GSH)的含量。随后采用免疫荧光、q PCR和免疫印记(Western Blot)三种方法对Bax、Bcl-2进行检测。利用JC-1染色对贾第虫滋养体刺激后的细胞内线粒体膜电位(MMP)进行检测,并检测细胞色素C(Cyt-C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、9(Caspase-3、9)以及多聚ADP核糖聚合酶(PARP)的含量变化。使用ROS的抑制剂(NAC)检测其对细胞活性以及线粒体凋亡通路的影响。通过在体实验,对小鼠进行NAC的干预,观察小鼠体重变化以及腹泻情况,肠道组织制备切片用HE染色,观察感染贾第虫后肠道组织的变化。实验结果显示,贾第虫滋养体在以10:1的比例刺激Caco-2细胞后,其培养液中LDH含量明显升高(P<0.01),表明贾第虫滋养体的刺激会对Caco-2细胞产生损伤。细胞凋亡与细胞周期的实验结果说明贾第虫滋养体可以诱导细胞发生凋亡引起细胞损伤,同时贾第虫滋养体的刺激会阻碍Caco-2细胞周期(G1期),促使G0/G1期细胞比例上调,S期与G2/M期细胞比例下调。通过电子显微镜观察发现贾第虫滋养体作用后会导致线粒体损伤。过多的ROS积累会导致细胞损伤进而诱发细胞凋亡,实验结果显示,在受到贾第虫滋养体刺激后,细胞内ROS的含量呈时间依赖性增加(P<0.01),而细胞内GSH水平明显下降(P<0.01),说明贾第虫滋养体的刺激破坏了细胞中氧化还原反应的平衡,引起细胞发生氧化应激反应。ROS诱导的氧化损伤可以调节Bax与Bcl-2水平的平衡,影响线粒体凋亡通路,实验结果显示受贾第虫滋养体刺激后的细胞内Bax的含量明显升高,而Bcl-2的含量显著降低。Bax/Bcl-2比值的增加能够诱导线粒体功能障碍,在对凋亡通路的进一步研究中发现,贾第虫滋养体刺激细胞后细胞内MMP不断下降,提示贾第虫滋养体能够增强Caco-2细胞线粒体膜的通透性。线粒体膜通透性增强会引起Cyt-C释放进入细胞质中,激活Caspase级联反应促使细胞发生凋亡,实验结果显示,贾第虫滋养体刺激细胞后线粒体中的Cyt-C释放到细胞质中,同时活化后的Caspase-3、9以及裂解的PARP水平明显升高。利用ROS抑制剂NAC验证ROS对于线粒体凋亡通路的影响,结果发现Caco-2细胞活性有明显提高(P<0.01),同时Cyt-C从线粒体释放到细胞质的含量以及活化后的Caspase-3含量都明显减少,表明贾第虫滋养体诱导的Caco-2细胞内源性凋亡明显依赖于ROS。在体实验中通过对小鼠进行NAC的干预,验证ROS对于贾第虫诱导细胞凋亡的作用,结果显示小鼠感染贾第虫后,体重有所减轻并伴有腹泻症状,解剖后发现肠段出现肿胀。肠道组织HE染色结果发现,小肠绒毛变短、萎缩甚至断裂,肠上皮细胞排列不规律,同时肠上皮细胞层完整性遭到破坏。用NAC抑制剂预处理过的感染小鼠其腹泻情况较轻且肠道无明显损伤,验证了ROS在引发内源性凋亡中的作用。本研究证明贾第虫滋养体刺激Caco-2细胞产生ROS,引起细胞发生内源性凋亡。通过调节细胞内Bax与Bcl-2含量的平衡,从而引起线粒体外膜通透性增加,激活MMP下降,促进Cyt-C的释放,进而激活Caspase-9和Caspase-3,促使PARP发生裂解,最终引发细胞凋亡。我们的发现有助于对贾第虫的致病机制进行更全面的了解,为贾第虫病的防治提供新的思路。