内毒素血症是引起人、畜多器官功能障碍而最终导致死亡的临床危症之一。鸡的内毒素血症,主要由革兰氏阴性菌引起。内毒素血症发生时,细菌胞壁中的内毒素大量释放进入血液,由外周血液循环汇集于肝脏进行代谢。其中,内毒素的主要活性成分脂多糖(LPS)可刺激机体产生大量的自由基,当过量的自由基未被及时代谢时,可直接攻击临近肝组织或肝细胞,导致一系列临床表现与病理变化。为阐明肝细胞在内毒素血症中的病理变化,从而揭示鸡内毒素血症的发病机制,本试验分为六部分,分别在肝细胞水平及线粒体水平上,研究了LPS对鸡肝细胞的作用影响。　　 具体内容如下:　　 1.本试验建立了改良的鸡原代肝细胞半原位灌流法,使用的胶原酶量仅为原位二步法的1/4,并获得纯度高、活力好、贴壁快的鸡原代肝细胞。由电镜结果可知鸡原代肝细胞结构完整,胞浆内线粒体含量丰富;由细胞活力(MTT)以及肝细胞功能指标(AST、ALT、TP、ALB、GGT和LDH)的结果可知,肝细胞活力好、功能正常且优于原位二步灌流法,同时还发现体外培养3～5 d的鸡原代肝细胞在活力与功能水平上差异不显著(P＞0.05),是进行体外试验的最佳时机。　　 2.应用三种不同浓度的LPS(0.1μg/mL,1μg/mL和10μg/mL)体外刺激鸡原代肝细胞,培养6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后采用MTT法测定细胞活力,同时测定肝细胞培养上清液与肝细胞AST、ALT、ALB、GGT、LDH和TP的活性。结果显示,在三种浓度LPS的刺激下,细胞增殖抑制率在6 h、12 h和24 h显著低于50％(P＜0.05),48 h时接近于50％,72 h时高达70％;肝细胞的生化功能发生明显变化,且与LPS的刺激时间存在明显(P＜0.05)的相关性,但与LPS的浓度无关(P＞0.05)。提示LPS可通过改变肝细胞的生化功能,抑制肝细胞的合成分泌作用,从而抑制鸡原代肝细胞的增殖,但其具体作用机制需下一步的深入研究。　　 3.应用1μg/mL的LPS体外刺激鸡原代肝细胞,分别在6 h、12 h、24 h、48 h和72 h时,采用微量法测定细胞抗氧化指标:GR、GPx、GSH和SOD,应用细胞流式仪检测细胞周期,应用TUNEL和琼脂糖电泳凝胶法研究细胞凋亡的情况,ELISA方法测定细胞凋亡因子caspase-3和-8,同时在电镜下观察细胞超微结构的改变。结果显示,细胞抗氧化功能在LPS刺激下,明显升高,细胞在G0/G1期的数量增加(P＜0.05)。但随LPS刺激时间的延长,GR和SOD活力受到明显抑制(P＜0.05),细胞凋亡率明显升高(P＜0.05),凋亡因子含量明显升高(P＜0.05),电镜观察发现细胞膜结构液化、空泡化,线粒体肿胀,细胞出现明显坏死。提示LPS可直接引起鸡原代肝细胞的抗氧化功能的障碍,活化细胞凋亡因子,诱导细胞凋亡或导致细胞坏死。　　 4.本试验建立了鸡原代肝细胞线粒体的提取方法,获得了具有体外活性的线粒体。经标志酶的活力检测及线粒体呼吸控制率(RCR),以及在电镜下观察的结果显示,该线粒体纯度较高,结构完整,适合进行进下一步的酶学检测。　　 5.应用1μg/mL的LPS体外刺激鸡原代肝细胞并于6 h、12 h、24 h、48 h和72 h提取线粒体,测定线粒体RCR、磷氧比(ADP/O)和氧化磷酸化效率(OPR),以及线粒体ATP酶(Na+-K+ ATPase和Ca2+-Mg2+ ATPase)的活性。结果显示,线粒体呼吸功能呈先升高后降低之趋势。ATPase活性在24 h时明显升高,在72 h时显著低于对照组(P＜0.05)。提示,LPS可刺激鸡原代肝细胞线粒体呼吸功能的改变,活化ATPase。但是随着LPS刺激时间的延长,线粒体的呼吸功能及ATPase的活性受到不同程度的抑制。　　 6.通过测定线粒体呼吸链H2O2的产生位点,研究线粒体呼吸链电子传递的情况,同时测定线粒体呼吸链复合体的活性,并结合两者分析LPS对鸡原代肝细胞线粒体自由基代谢的影响。结果发现,对照组H2O2的产生主要在AA(复合体Ⅲ抑制剂)的结合位点。应用LPS刺激后,线粒体呼吸链电子漏的主要部位发生改变,6 h在Olig(ATPase抑制剂),12 h在Myxo(复合体Ⅲ),24 h、48 h和72 h在Rot(复合体Ⅰ抑制剂)。线粒体呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ的活性与对照组比明显受到抑制(P＜0.05)。提示,LPS可通过抑制鸡原代肝细胞线粒体呼吸链复合体的活性,影响呼吸链电子的传递,造成线粒体呼吸功能发生障碍,ATP的合成受到抑制。