研究目的男性不育（Male infertility）在不孕不育中占很大的比例,其常见原因包括化疗、辐射、医源性损伤等。联合国原子辐射效应科学委员会（United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation,UNSCEAR）提出,人类接触的主要电离辐射（Ionizing radiation,IR）来源是医疗辐射,在医疗相关辐射增加的同时,近几十年里男性精液质量有明显下降趋势。为了降低医疗辐射源对生殖系统的影响,近年来推崇三维适形精确放疗（3-Dimentional conformal radiation therapy,3DCRT）等局部精准放疗,以控制照射野形态及射线束强度,从而减少靶区以外的重要器官受到辐射。值得注意的是,适形放疗和精确放疗也可能对照射位置附近或远处的组织器官造成影响,这种效应被称为辐射诱导的远处效应（Abscopal effect）。因此,从分子细胞水平探索电离辐射远处效应致男性不育的机制,寻找新的预防和治疗方法,对于长期暴露于电离辐射环境的医务工作者和患者尤为重要。已有的研究表明,全肺大分割辐射（Hypofractionated radiation）可通过远处效应导致雄性小鼠睾丸支持细胞损伤,且局部电离辐射会通过远处效应造成精子DNA损伤和表观遗传学改变。并且有学者提电离辐射可通过影响细胞膜稳态结构,促进包括外泌体（Exosomes）在内的细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）产生,并通过循环系统运输到辐射暴露区域以外的其他部位,从而对其他组织器官功能产生影响。睾丸生精上皮中的精子发生受到由睾丸支持细胞（Sertoli cells）组成的特定屏障的保护,支持细胞屏障又称血-睾屏障（Blood-testis barrier,BTB）,主要由支持细胞和其间的紧密连接（Tight junctions,TJs）、缝隙连接（Gap junctions,GPs）、基底部外质特化（Ectoplasmic specialization,ES）和桥粒共同构成。BTB作为哺乳动物体内最紧密的血-组织屏障之一,可以防止有害的内源性或外源性物质进入生精小管,为精子发生提供稳定的生精微环境。本研究希望通过建立科学合理的局部电离辐射动物模型,以及局部电离辐射小鼠血浆外泌体和和支持细胞的共孵育体外模型,探索外泌体在介导局部电离辐射远处效应中的作用,并进一步研究其影响BTB和支持细胞的细胞与分子生物学机制,为预防和治疗电离辐射远处效应导致男性不育提供新的潜在靶点和理论依据。研究方法1.使用Co60-γ射线辐射源建立全肺局部辐射（Whole lung irradiation）雄性小鼠模型,分别使用2Gry,4Gry,6Gry和8Gry辐照剂量连续3日分次辐照（Hypofractionated irradiation）方法建模。2.取上述小鼠模型不同剂量组辐照后24小时和48小时睾丸组织,通过H＆E染色观察不同剂量-时间条件下睾丸组织变化。3.提取上述不同剂量辐射组小鼠模型血浆外泌体,进行外泌体特征鉴定,并与TM4细胞系共孵育不同时间,利用ROS检测和细胞毒性检测实验摸索TM4细胞损伤的剂量-时间条件。4.提取上2Gry剂量连续3日分次辐照的小鼠模型血浆外泌体,进行蛋白质谱检测和生物信息学分析,获得蛋白质组学数据结果;收取小鼠模型睾丸组织,对小鼠睾丸组织进行免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）染色,检测BTB相关蛋白（Occludin、F-Actin、ZO-1和α-Tubulin）表达情况。5.对上述小鼠模型睾丸组织进行免疫荧光染色,检测生殖细胞标志物（GCNA1）、支持细胞标志物（GATA4和ERM）、和巨噬细胞标志物（F40/80）表达情况,探索具体细胞损伤类型;制备上述睾丸组织精细胞悬液,通过PI染色流式周期分析检测生精周期改变,并用ELISA实验检测小鼠血清中睾酮和抑制素B水平的变化。6.通过Me DIP甲基化芯片和m RNA转录组芯片检测局部电离辐射小鼠睾丸组织,并对甲基化与转录组数据联合分析,结合RT-PCR和WB实验筛选电离辐射远处效应致小鼠睾丸损伤的关键基因,并通过免疫荧光共定位实验检测关键基因的具体细胞定位。7.通过透射电镜实验,观察与局部电离辐射小鼠血浆外泌体共孵育的TM4细胞超微结构改变,细胞免疫荧光（ICC）实验检测验证小体关键组分NLRP3表达和ASC斑点蛋白的形成。8.提取与局部电离辐射小鼠血浆外泌体共孵育的TM4细胞的蛋白,同时提取动物模型小鼠睾丸组织蛋白,用WB实验检测焦亡通路NLRP3/Gsdma2/Caspase-1/IL-1β的变化情况。9.构建利用lv-Gsdma2-RNAi慢病毒敲低Gsdma2基因的TM4细胞稳转株,用WB、PCR实验验证Gsdma2对Caspase-1和IL-1β的下游作用机制,并利用ELISA实验检测IL-1β在胞外的水平。10.利用细胞因子蛋白检测芯片,检测上述小鼠模型睾丸组织中200种细胞因子的变化,结合生物信息学分析找到焦亡过程上游关调节通路NF-κb通路,并使用NF-κb抑制剂和WB实验进行验证。研究结果1.成功建立2Gry剂量连续3日分次辐照的全肺（Whole Lung Irradiation）电离辐射小鼠模型,H＆E染色结果提示睾丸组织出现明显的生精小管间质肿胀松散、基底部细胞脱离基底膜、以及生精过程阻滞的现象;上述小鼠模型浆外泌体与小鼠支持细胞TM4共孵育48小时条件下,细胞毒性显著上升。2.局部电离辐射下小鼠血浆外泌体蛋白质组学结果显示,局部电离辐射小鼠血浆外泌体中与BTB重塑和破坏相关的蛋白酶和肽酶显著上调;小鼠睾丸组织免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）染色结果显示,BTB相关蛋白（Occludin、F-Actin、ZO-1和α-Tubulin）显著下调;上述结果共同提示,局部电离辐射可能通过外泌体介导的远处效应导致小鼠BTB超微结构遭到破坏。3.上述条件局部电离辐射导致小鼠睾丸组织显著破坏,GCNA1、GATA4和ERM表达显著下调,F40/80显著上调,提示精细胞显著和支持细胞显著减少、间质巨噬细胞浸润增多。4.上述条件局部电离辐射导致雄性小鼠睾丸精细胞进入S期比例显著下降,小鼠血清睾酮和抑制素B水平无显著改变,提示生精周期阻滞,且该过程是非性激素依赖性的。5.甲基化芯片和m RNA转录组芯片检测局部电离辐射小鼠睾丸组织,结果表明局部电离辐射远处效应可导致小鼠睾丸组织中基因启动子甲基化水平和基因转录组水平发生显著改变。6.甲基化与转录组数据联合分析找到Gsdma2和F730043M19Rik等九个候选基因,RT-PCR和WB实验明确Gsdma2在局部电离辐射小鼠睾丸中表达量变化最为显著。7.免疫荧光共定位实验中,Gsdma2和GATA4呈现出显著共表达现象,提示Gsdma2可能是局部电离辐射远处效应致小鼠睾丸支持细胞损伤的关键基因。8.透射电镜实验观察到,与局部电离辐射小鼠血浆外泌体共孵育的TM4细胞膜出现“打孔现象”,细胞免疫荧光（ICC）实验证实了NLRP3/ASC炎症小体的组装,提示支持细胞可能发生焦亡。9.WB实验揭示了与局部电离辐射小鼠血浆外泌体共孵育的TM4细胞中,焦亡通路NLRP3/Gsdma2/Caspase-1/IL-1β显著上调,该现象同样在局部电离辐射小鼠模型睾丸组织中用WB实验得到验证。10.进一步研究显示,在局部电离辐射外泌体介导的远处效应导致支持细胞焦亡过程中,Gsdma2切割Caspase-1和IL-1β,使IL-1β释放到胞外。11.细胞因子检测芯片和生物信息学分析提示,NF-κb信号转导通路在局部电离辐射小鼠睾丸中显著上调,结合WB实验结果,显示NF-κb是支持细胞焦亡过程上游的关键调节因子。研究结论低剂量分次局部（全肺）电离辐射可通过外泌体介导的远处效应,导致血-睾屏障超微连接破坏和支持细胞死亡,进而引起非性激素依赖性生精周期阻滞。局部电离辐射远处效应可导致小鼠睾丸中大量基因基启动子甲基化和转录水平显著改变,其中Gsdma2基因启动子甲基化水平降低,呈现出在支持细胞中的高表达。局部电离辐射通过外泌体介导的远处效应诱导支持细胞发生焦亡,Gsdma2在其中发挥关键作用。NLRP3/ASC炎症小体复合物组装形成后激活Gsdma2蛋白,Gsdma2切割Caspase-1和IL-1β,伴随炎症因子cleaved-IL-1β释放到胞外,并且转录因子NF-κb在焦亡过程上游起到关键调节作用。Gsdma2有可能成为预防和治疗电离辐射致男性不育的潜在基因靶点。