超声微泡介导siMDR1转染提高睾丸肿瘤化疗效果的实验研究

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睾丸肿瘤是生殖系统常见肿瘤,临床上恶性睾丸肿瘤化疗效果不佳是影响治疗结果的重要原因。研究发现与肿瘤多药耐药相关的P-糖蛋白在睾丸毛细血管内皮细胞上高表达形成一种生物学屏障,阻止化疗药物的进入,这可能在睾丸肿瘤的耐药中发挥了重要作用。如何突破这道屏障而逆转耐药,就成为睾丸肿瘤治疗中的难点。本课题拟采用基因沉默的方法,用携带MDR1基因特异性小干扰RNA的真核表达质粒pSEB-siMDR1去抑制血管内皮细胞中P-糖蛋白的表达和功能,从而促进化疗药物进入睾丸组织中。但高效定向的体内基因转染是本研究的关键点,超声微泡的应用为实现体内靶向转染siMDR1基因提供了一种可靠的新方法。携带pSEB-siMDR1质粒的微泡,由静脉注入可通过循环到达睾丸,在超声作用下破坏微泡实现siMDR1小干扰RNA体内向睾丸毛细血管内皮细胞的靶向转染,抑制P-糖蛋白表达和功能,为化疗药物进入睾丸内有效杀灭肿瘤提供了条件,从而提高睾丸肿瘤治愈率。基于以上设想,本课题的研究内容包括以下4部分。第一部分携带siMDR1的真核表达质粒构建及功能鉴定目的:构建pSEB-siMDR1真核表达质粒,并通过检验其对内源性MDR1基因及P-糖蛋白表达和功能的抑制效果,筛选出有效的siMDR1序列。方法:设计4对特异性针对大鼠MDR1基因的siRNA序列,退火后分别与pSEB-HUS质粒连接,重组获得pSEB-siMDR1真核表达质粒,PCR、酶切及测序鉴定插入片段。通过脂质体分别将4种pSEB-siMDR1转染到L2RYC细胞,并设置pSEB-HUS空质粒作为对照,以及等量混合共转染组(siMDR1Pool)。转染48h后提取各组的总RNA和总蛋白,用real-time PCR及Western-blot检测MDR1的mRNA及蛋白表达,并用MTT法检测转染后长春新碱对L2RYC细胞增殖的影响。结果:重组获得的4种pSEB-siMDR1经PCR扩增均可检测到约300bp的条带,pSEB-HUS空质粒对照无此条带;NotⅠ酶切pSEB-HUS对照可获得1321bp和>5000bp条带各一条,重组成功的质粒仅有>6000bp一条带。重组质粒送测序,结果与所设计的siRNA序列完全一致,4种pSEB-siMDR1质粒构建成功。各组转染后均可见绿色荧光表达,siMDR1-1,-2,-3和-4均能不同程度抑制MDR1基因表达,siMDR1Pool组抑制效率最高,其中siMDR1-1,-2,-3和Pool组与对照组相比有统计学差异(P<0.05),而siMDR1-4与对照相比无统计学差异(P>0.05)。P-糖蛋白表达与MDR1基因表达情况一致。抑制后,长春新碱使L2RYC细胞的增殖降低,siMDR1Pool组最明显结论:重组pSEB-siMDR1真核表达质粒构建成功,能有效抑制MDR1基因和蛋白的表达,siMDR1Pool能最好地抑制MDR1的内源性表达,因此后续实验将选用siMDR1Pool进行转染。第一节超声联合微泡体外细胞转染最适条件筛选目的:探讨超声联合微泡体外转染细胞的主要影响因素,筛选pSEB-siMDR1质粒转染L2RYC细胞的最适条件。方法:机械振荡法制备脂质微泡,然后用PLL吸附法将pSEB-HUS质粒分层包裹在微泡外表面,制成载基因微泡。用不同强度的超声和不同超声暴露时间组合作为转染的条件,台盼蓝染色检验转染后细胞的存活率,流式细胞仪检测质粒的转染效率。结果:不同细胞转染的条件不同,随着超声强度和暴露时间增加,转染效率不断增高,超过一定限度后细胞死亡也明显增加而不能用于后续实验。当超声强度0.5W/cm2以及暴露时间为30s时,能保证90%以上细胞存活且转染效率26%。结论:适合的超声强度和暴露时间能够明显促进质粒转染细胞,并不会对细胞存活产生明显的影响。第二节超声联合微泡促pSEB-siMDR1转染降低细胞对化疗药物耐药目的:研究超声联合载pSEB-siMDR1微泡的体外转染效率以及转染后对MDR1基因及P-糖蛋白表达和功能的抑制。方法:将pSEB-siMDR1质粒或制备的携带pSEB-siMDR1质粒的脂质微泡加入培养的细胞中,设置实验分组:①单纯质粒组(Ⅰ组)②质粒+超声组(Ⅱ组)③载基因微泡组(Ⅲ组)④载基因微泡+超声组(Ⅳ组)⑤空白对照组(Ⅴ组)⑥脂质体对照组(Lipo组),用超声参数0.5W/cm2、30s进行照射,转染后用流式细胞计数检测GFP阳性细胞率,实时荧光定量PCR及Western-blot检测转染后MDR1mRNA及P-糖蛋白的表达。最后,用柔红霉素蓄积实验检测细胞膜上P-糖蛋白的功能,MTT法检测长春新碱和更生霉素对细胞增殖的影响。结果:仅Ⅳ组和Lipo组转染后L2RYC细胞内有绿色荧光表达,流式细胞计数定量转染率Ⅳ组31.9%,明显高于其余各组(P<0.05)。Ⅳ组转染后L2RYC细胞的MDR1mRNA及P-糖蛋白的表达降低,其余各组无明显变化。Ⅳ组柔红霉素在细胞内蓄积高于其余各组(P<0.05)。Ⅳ组长春新碱和更生霉素IC50为1.34μg/ml和0.11μg/ml,明显低于其余各组(P<0.05)。结论:仅在超声与微泡造影剂同时存在的情况下,能显著提高pSEB-siMDR1质粒转染L2RYC细胞的效率,并显著抑制MDR1基因及P-糖蛋白的表达和功能。抑制后,L2RYC细胞对化疗药物的敏感性提高。第三部分超声联合微泡促pSEB-siMDR1体内靶向转染第一节大鼠睾丸肿瘤动物模型的建立目的:以卵黄囊瘤为例,建立睾丸肿瘤大鼠动物模型的制备方法。方法:分别选取3周龄和3月龄的雄性SD大鼠,将培养的L2RYC细胞分别制备成的细胞悬液,无菌操作下将10μl细胞悬液注入右侧睾丸网内。各年龄大鼠分别设3组,接种细胞量为1×106、1×107和1×108,左侧为自身对照,每个处理组10只。术后每周测量睾丸直径,进行B超检查,观察睾丸肿瘤生长情况,并取睾丸行HE染色及免疫组化检查。结果:注入1×108细胞后,无论3周龄或3月龄鼠均在1-2周内睾丸迅速增大破溃,B超见明显内部液化,病理组织检查提示为坏死灶,大鼠短期内衰竭死亡。细胞量为1×107时,3月龄鼠成瘤率仅12.5%,3周龄鼠在接种后肿瘤逐渐发生,3周成瘤率100%,随着肿瘤生长大鼠全身状态恶化,4周开始先后死亡。成瘤鼠的睾丸B超提示为密度均匀稍低的肿块部分有低回声区;HE染色为疏松网状结构,可见嗜酸性小体和S-D小体;免疫组化Cspg4染色阳性。接种细胞量为1×106时,至实验终点未见成瘤。结论:用1×107细胞是制备模型较合适的剂量,细胞过多使睾丸短期内坏死,过少则不能成瘤。制备的大鼠睾丸卵黄囊瘤模型的组织学表现与临床相似,可以用于后续实验。第二节超声联合微泡促pSEB-siMDR1靶向转染睾丸血管内皮目的:探讨应用超声联合微泡介导pSEB-siMDR1转染大鼠睾丸毛细血管内皮的可行性,以及转染后对毛细血管内皮细胞中MDR1基因,P-糖蛋白表达和功能的抑制效果。方法:包载pSEB-siMDR1质粒的脂质微泡由大鼠尾静脉注入,5分钟后在睾丸部位开始连续照射10分钟,设置实验分组:①单纯质粒组(Ⅰ组)②质粒+超声组(Ⅱ组)③载基因微泡组(Ⅲ组)④载基因微泡+超声组(Ⅳ组)⑤空白对照组(Ⅴ组),冰冻切片用荧光显微镜检测pSEB-siMDR1质粒的转染定植部位,PCR和western blot检测转染后MDR1基因和P-糖蛋白的表达。用荧光显微镜检测不同处理后,柔红霉素在睾丸组织中的存留情况。结果:超声作用后,仅在Ⅳ组的毛细血管壁上可见绿色荧光蛋白的表达,转染后MDR1基因和P-糖蛋白表达明显降低(P<0.05),柔红霉素的红色荧光在Ⅳ组睾丸组织内蓄积明显多于其余各组。结论:超声联合微泡能促进pSEB-siMDR1对大鼠睾丸毛细血管的转染,抑制P-糖蛋白的表达及其药泵功能,使化疗药物更容易在睾丸组织内积聚。第四部分超声联合微泡靶向转染pSEB-siMDR1提高睾丸肿瘤化疗效果的实验研究目的:探讨应用超声联合微泡转染pSEB-siMDR1到荷瘤鼠睾丸内,能否提高其化疗效果。方法:将建模成功的大鼠分组:①单给化疗药(A组)②微泡+超声+化疗药(B组)③载基因微泡+超声+化疗药(C组)④对照组(D组);监测肿瘤的生长及荷瘤鼠存活率,给药完后1周处死大鼠,取睾丸组织检测指标:比较各组肿瘤的大小、重量;HE染色后观察肿瘤病理变化;PCR检测凋亡相关基因Fas、P53的表达。结果:加用化疗药物后,C组大鼠肿瘤生长抑制,相对睾丸体积均明显小于其余各组,同一时间点存活率也高于其余各组,肿瘤细胞减少,睾丸部分形态保留;Fas和P53基因表达增加。结论:超声联合微泡靶向转染pSEB-siMDR1能够提高睾丸肿瘤的化疗效果,增加肿瘤细胞的死亡,使荷瘤鼠存活率提高。
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