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结节性硬化症(Tuberous Sclerosis Complex,TSC)是一种在多器官发生良性肿瘤的常染色体显性疾病。该疾病表现出多种临床病症,如癫痫、自闭症、肾血管平滑肌瘤等。结节性硬化症由肿瘤抑制基因TSC1和TSC2发生突变所致,不同突变导致的病症和严重程度都不同。这两个基因分别编码的TSC1和TSC2蛋白形成TSC1/2复合物,在mTOR信号通路中起到负调控的作用。TSC1/2复合能够整合上游的氨基酸、生长因子、能量、低氧和细胞因子等生长信号,转化为TSC1和TSC2不同位点的磷酸化状态。TSC2的GTP酶激活蛋白(GAP)结构域活化Rheb(Ras homolog enriched in brain GTPase),从而抑制mTORC1(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1,mammalian target of rapamycin complex 1)的活性,降低细胞的合成代谢水平。该复合物的结构学研究有助于揭示其调控机理。本研究表达和纯化人和裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(S.pombe)的TSC1和TSC2蛋白,进行结晶尝试。我们利用大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)表达TSC1的coiled coil结构域和TSC2的GAP结构域,裂殖酵母TSC1 540-675 aa的MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白表达较好,但聚合度高;TSC2完整的GAP结构域沉淀,人TSC2 1516-1708 aa可溶,但与人Rheb共点晶不结晶。用昆虫细胞Sf9共表达裂殖酵母TSC1和TSC2蛋白,TSC1全长(TSC1 FL)和TSC2全长(TSC2 FL)表达量低;TSC1的C端截短,如1-799 aa、1-718 aa表达量较高;TSC2的C端截短表达量不如TSC2 FL;Anti-Flag亲和纯化Flag-TSC2同时拉出His-TSC1,可得到纯度高的TSC1/2复合物,解决了TSC1表达量高于TSC2的问题;TSC1需要一定长度的coiled coil来稳定TSC2,部分C端截短的TSC1 1-718 aa或1-799 aa和TSC2FL共表达有利于提高TSC2的表达量。裂殖酵母TSC1以二聚体的形式存在;TSC1结合TSC2,TSC1/2复合物会聚合成分子量大于1 MDa的多聚体;TSC2的N端和GAP结构域可以分开,TSC1和TSC2的N端结合。Expi293F表达系统适合人TSC1 FL和TSC2 FL的表达,但表达量较低,截短蛋白的表达情况不如全长。总之,本研究对TSC1和TSC2的表达和纯化进行了深入的探索,阐释了蛋白的一些结构性质,研究结果和提出的方法为TSC1和TSC2的结晶研究奠定了重要基础。