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岩藻多糖和低分子量岩藻多糖(LMWF)具有多种生物学活性。低分子量岩藻多糖也具有很强的生物学活性,并且避免了岩藻多糖的抗原性和毒副作用。岩藻多糖酶可部分降解岩藻多糖,得到LMWF并且保留硫酸基团。另外LMWF还可以作为解析岩藻多糖结构的工具。因此,对岩藻多糖酶的研究具有十分重要的意义。本文主要研究了岩藻多糖酶产生菌的筛选,鉴定及液态发酵。
对我国厦门海域采集的不同样品(包括海水,海砂,海泥,软体动物,海苔,朽木等),用稀释平板法分离海洋真菌,共分离到真菌129株。以岩藻多糖为唯一碳源,经过初筛和复筛得到28株岩藻多糖酶产生菌,占所筛真菌数的21.7%。海泥和朽木中分离出来的具有岩藻多糖酶活性真菌所占比例最高,各占33.3%。其中菌株PZ322的岩藻多糖酶产量最高,酶活力为3.83 IU/ml,且发酵性能较稳定,被确定为下一步研究的出发菌株。
然后我们对该菌株进行了形态学鉴定,初步鉴定其为曲霉属的成员。同时菌株PZ322 ITS序列与从GENBANK获取的序列比对,其中较有鉴定意义的是序列GU183175.1(Aspergillus fumigatus isolate HF11)和AY373884.1(Aspergillus wentii strain ATCC1023),与该菌株相似序列达到100%。Aspergillus fumigatus的产孢结构为单层,而菌株PZ322的形态学鉴定结果却是双层产孢结构,因此,我们将此菌株鉴定为 Aspergillus wentii(PZ322)。目前文献资料上还没有温特曲霉产岩藻多糖酶的报道。
为了提高岩藻多糖酶的产量,对其液态发酵培养基组成和培养条件进行优化。单因子实验结果表明,PZ322产岩藻多糖酶的较优培养基为(%):麸皮5,海带粉2,(NH4)2SO40.4,起始pH调为6.5。培养条件为250ml三角瓶装液量为80ml,接种量为5%,摇床转速为180rpm,温度为28℃,培养48h时,酶活力达到6.90 IU/ml。
为进一步提高岩藻多糖酶的产量,我们对菌株P2322进行了三次低能量(15 Kev)的氮离子注入诱变。结果表明,较低的注入剂量(30单位)下,有利于突变菌株的产生。经过两轮诱变后,筛选出较高产菌株2041,液态发酵48h后酶活力为8.89IU/ml。
最后我们对 Aspergillus wentti PZ322菌株岩藻多糖酶的分离纯化进行了初步的探索。通过粗酶液前处理,经10万Da,5万Da,3万Da,1万Da超滤膜分级成5个级分,酶活力的测定结果表明岩藻多糖酶主要在3万Da以下级分和5-10万Da级分。本文选择5-10万级分,分别进行Sephadex G-100柱层析和Superdex200柱层析,但PAGE鉴定结果都没有得到单一的条带,还需进一步纯化。