s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及蛋白分析

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S-腺苷甲硫氨酸是由S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L-甲硫氨酸和ATP所生成。S-腺苷甲硫氨酸可以作为甲基和丙胺的供体,是改善细胞代谢,营养肝脏、消炎、减轻疼痛及组织修复的生化医药,对于各种慢性肝脏疾病及关节炎疾病具有很好的疗效。  本文首先考察了不同来源(大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在不同的pET表达载体[pET-32a(+)、pET-43.1(+)、pET-44a(+)、pET-4.8b(+)、pET-49b(+)]与不同的宿主菌[BL21(DE3)、Origami(DE3)、OrigamiB(DE3)、Rosetta-gami(DE3)和Rosetta-gamiB(DE3)]表达情况,从而选择出最佳组合。结果显示:将酵母来源的SAM合成酶基因与pET-44a(+)质粒连接,在Origami(DE3)菌株中表达有最佳的效果。其发酵条件:37℃200rpm,培养2hr,其比酶活在60U左右。  论文进一步对不同来源的SAM合成酶的碱基序列进行比对,分析了其相应保守序列,并对这些位置的碱基进行删除,初步探究了SAM合成酶的性质。结果显示:通过碱基删除,酶活没有增加,说明这些位点不是解除产物抑制的位点。  最后利用分子模拟软件,运用同源建模方法预测蛋白结构,运用分子对接技术寻找底物与酶活性位点,为后续蛋白分子结构的定向改造打下基础。
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