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目的:糖尿病肾病是最主要的糖尿病微血管病变之一,也是导致终末期肾病的首要原因,严重影响患者的生活质量,目前在中国的发病率日益增加。糖尿病肾病患者在确诊时病情大多已经比较严重,而目前尚缺乏特异性诊断糖尿病肾病早期发病的有效标准,因此寻找特异性较高的生物标志物就变得极为重要。蛋白组学作为一种常用技术手段,可用于检测不同疾病状态间的蛋白表达情况。尿液具有取材方便、无创伤等优点,在临床诊断中具有十分重要的作用。本实验旨在通过检测不同分期糖尿病肾病患者尿液蛋白表达情况,筛选差异蛋白,加以验证,以寻找更有效的糖尿病肾病早期诊断标志物,并通过进一步的细胞实验,了解其可能的作用机制。方法:一、蛋白组学研究:根据尿ACR水平选取确诊的2型糖尿病患者18例(男、女性别比例为1:1),分为正常蛋白尿组(NA)、微量蛋白尿组(MA)和大量蛋白尿组(LA),并选取年龄、性别匹配的6例健康体检者作为正常对照组(NC),收集其晨起清洁中段尿组内混合。所有尿液样本经离心、冷丙酮沉淀后获得尿蛋白,去除高丰度蛋白后,于质谱分析仪中行质谱分析,并选取表达差异倍数大于1.5或小于0.667的作为差异蛋白。二、人群验证:分别纳入性别、年龄匹配的2型糖尿病患者90例,依据尿ACR水平分为正常蛋白尿组、微量蛋白尿组和大量蛋白尿组,并按年龄与性别匹配30例健康体检者作为正常对照组。分别收集患者晨起清洁中段尿,分别用相应ELISA检测试剂盒检测其尿液中差异蛋白的表达情况。三、细胞实验:分别用正糖(5.6mM)和高糖(25mM)培养人肾小球系膜细胞24h后,分别用qPCR和Western Blot技术检测差异蛋白mRNA及上游miRNA和细胞外基质蛋白mRNA表达情况及其蛋白表达情况。加入miRNA抑制剂和模拟物后,分别检测RNA和蛋白的表达变化。研究结果:一、蛋白组学研究:正常对照组和不同分期糖尿病肾病患者尿液中分别检测出蛋白质各537、467、398和439种,经筛选比较,共发现肾病患者中表达上调蛋白12种,下调蛋白19种,根据生物信息学分析结果,EGF和THBS1可能是参与糖尿病肾病发病的重要蛋白。二、人群验证:1.尿EGF和THBS1在肾病患者尿液中的表达均较NC组低(p<0.05),并随糖尿病肾病进展,其表达量逐渐减少。2.校正年龄、性别干扰后分析显示,EGF与DKD组患者病程、BMI、家族史、HbA1C、uMA呈负相关(r=-0.121,-0.155,-0.380,-0.125,-0.281,均p<0.05,THBS1与DKD患者病程、家族史、HbA1C、SBP、uMA呈负相关(r=-0.109,-0.274,-0.150,-0.821,-0.283,p<0.05)。3.在糖尿病患者及正常人群中筛选出微量白蛋白尿患者的EGF的AUC为0.804(95%CI:0.708-0.882),取9.0512作为诊断截点时,其灵敏度及特异度分别为81.2%和46.3%,区分早期糖尿病肾病和临床糖尿病肾病的AUC为0.876(95%CI:0.729-0.982),当取临界值4.8732时,约登指数最大为61.7%,灵敏度与特异性分别为96.6%及65.1%。三、细胞实验:1.与正糖组相比,高糖培养的人肾小球系膜细胞中miR192表达增加,CAV1表达减少,EGF表达增加,细胞外基质COLI、FN表达增加,细胞迁移和增殖增加。2.与对照组相比,加入miR192抑制剂后,CAV1表达增加,EGF表达量减少,细胞外基质表达情况改善,细胞迁移和增殖减少;加入miR192模拟物后,CAV1表达下降,EGF表达量增加,细胞外基质表达量增加,细胞迁移和增殖增加。结论:1.本研究证实不同糖尿病肾病分期患者尿液蛋白表达谱不同,尿液蛋白组学可以作为发现糖尿病肾病诊断标志物的重要来源。2.尿液EGF和THBS1与糖尿病肾病进展关系密切,尿EGF在区分早期糖尿病肾病和临床糖尿病肾病,以及从非糖尿病肾病患者中区分微量蛋白尿时显出了良好的应用价值,提示尿EGF可以作为糖尿病肾病的特异性诊断标志物。3.EGF在糖尿病肾病不同分期中的表达具有明显差异。miR192和CAV1调控EGF的表达并调节细胞外基质的表达以及细胞迁移和增殖,参与糖尿病肾病的发生发展,引起EGF在不同糖尿病肾病分期中的表达差异。4.高糖经由miR192-CAV1-EGF途径参与调控肾小球系膜细胞细胞外基质的形成。