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绝大多数死于恶性肿瘤的患者,死因为远处转移的出现和进展。恶性肿瘤转移的理论有多种,现在仍然没有定论,但是不可否认的是,远处转移必然经过的是肿瘤细胞通过循环系统的播散。播散进入循环系统中的肿瘤细胞,我们称之为循环肿瘤细胞(CTCs, circulating tumor cells),正在吸引越来越多肿瘤研究者的兴趣。近十几年,随着循环肿瘤细胞检测技术的不断发展,多项研究表明循环肿瘤细胞的检测在实体瘤的诊断、分期、预后、个体化治疗、肿瘤细胞特征研究等方面具有极大的潜力。肺癌是临床常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率在世界范围内已经逐渐升至首位,给人们的健康和国家经济发展都带来了很大的威胁。肺癌治疗发展到今天,传统的治疗手段得到了新的发展,新的治疗手段也纷纷涌现,在综合治疗和个体化治疗日益深入人心的今天,肿瘤本身的异质性和患者个体状况的复杂性考验着肿瘤医生对治疗手段和策略的选择。作为肺癌治疗的重要手段之一,多项研究证实中医药参与治疗能有效延长患者生存时间、减少或延缓术后复发、改善生活质量以及减轻临床症状。为了探索循环肿瘤细胞检测在中医药参与治疗晚期非小细胞肺癌患者中的地位和作用,本研究应用一种新发展的循环肿瘤细胞检测技术,进行了初步的实验室和临床的研究。目的:①检测免疫磁珠阴性分选及免疫荧光染色技术对肺癌细胞系A549细胞富集的效率、稳定性和特异性,并进一步应用该技术进行临床实验以研究以下几个问题。②探讨晚期非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞阳性率和数量与各因素的关系。③探讨治疗前和第一周期治疗后循环肿瘤细胞数量的变化与两周期中医或中西医结合治疗后影像学评价之间的关系。④探讨循环肿瘤细胞数量对接受中医或中西医结合治疗的晚期非小细胞肺癌患者总生存时间(OS)和疾病无进展生存时间(PFS)的预测价值。方法:①实验室研究:抽取20份健康志愿者提供的外周静脉血,每份7ml,随机等分为2组,每组10人份,两组各加入10个以内、10-100个之间的荧光标记的肺癌细胞系A549细胞。经免疫磁珠阴性分选后计数相应回收的肿瘤细胞数目,计算该技术对A549细胞的富集效率及稳定性。另抽取10位非肿瘤患者外周静脉血,经免疫磁珠阴性分选及免疫荧光染色技术计数,检验该技术对非肿瘤患者检测的特异性。②临床研究:中国中医科学院广安门医院肿瘤科住院的晚期非小细胞肺癌患者,在接受中医治疗或中西医结合治疗前、一周期治疗后进行两次循环肿瘤细胞检测,同期记录患者的肿瘤标记物、功能状态评分、中医辨证分型等信息;两周期后影像学评价疗效;随后进行随访,判定患者的总生存时间和疾病无进展生存时间,最后统计相关数据得出结论。结果:①10个以内(101个)细胞组,平均富集效率为83.00%±8.23%,10-100个(102个)细胞组,平均富集效率为84.80%±4.44%,P=0.55;加入细胞数量和富集细胞数量之间线性相关Pearson相关系数为0.998,P<0.01;线性回归分析R2=0.996,线性回归方程:Y=-0.545+0.873X,P=0.000;10例进行特异性检验的非肿瘤患者,均未检测出循环肿瘤细胞的存在。②63例入组的患者,中医组33人,中西医结合组30人。从基线循环肿瘤细胞检测结果来看,共50例检测结果为阳性,阳性率为79.4%;最多检测出18个肿瘤细胞,总体数量均值为5.75±4.71个。其中,ⅢB期和Ⅳ期患者循环肿瘤细胞阳性率分别为59.1%(13人)和90.2%(37人),P=0.007;均值分别为2.73±3.58个和7.37±4.48个,P=0.000。原发灶直径≥3cm和<3cm的患者,阳性率分别为85.4%(35人)和68.2%(15人),P=0.190;均值分别为6.71±4.72个和3.95±4.25个,P=0.026。病理分化程度为高分化、中分化、低分化和未分化的患者,均值分别为3.25±4.17个、4.24±3.65个、6.24±4.34个和8.29±5.46个,P=0.019;LSD法两两比较,高分化和未分化(P=0.010)、中分化和未分化(P=0.007)组间均值差别有统计学意义。功能状态评分(Kps)为60分、70分、80分和90分的患者,均值分别为8.54±5.11个、6.50±4.50个、5.32±4.46个和2.54±3.07个,P=0.008;LSD法两两比较,60分的患者与80分(P=0.045)和90分(P=0.001)的患者比较,基线循环肿瘤细胞均值差异有统计学意义;70分的患者与90分(P=0.016)的患者,循环肿瘤细胞均值差异有统计学意义。③第一周期治疗后与基线比较,循环肿瘤细胞数量变化和肿瘤标记物积分变化与金标准影像学评价之间的一致性检验采用ROC曲线检验。53例循环肿瘤细胞变化可评价的患者,ROC曲线下面积为0.755,P=0.002;46例肿瘤标记物积分可评价者,ROC曲线下面积为0.683,P=0.035;40例肿瘤标记物积分和循环肿瘤细胞均可评价的患者,循环肿瘤细胞ROC曲线下面积为0.734,P=0.012;肿瘤标记物ROC曲线下面积为0.730,P=0.014;16例初治且循环肿瘤细胞可评价患者,ROC曲线下面积为0.865,P=0.015;14例初治且肿瘤标记物和循环肿瘤细胞均可评价患者,循环肿瘤细胞ROC曲线下面积为0.908,P=0.011;肿瘤标记物ROC曲线下面积为0.837,P=0.035;中医治疗组中,循环肿瘤细胞可评价患者,ROC曲线下面积为0.679,P=0.135;中西医结合治疗组中,循环肿瘤细胞可评价的患者,ROC曲线下面积为0.822,P=0.005。以不同的循环肿瘤细胞变化值为截点,发现以2为截点,即增加3个及以上判定为进展时,其进展预测值可达到86.67%;以-3为截点,即减少3个及以上判定为有效时,有效预测值达77.78%。④多因素Cox回归分析,基线循环肿瘤细胞数量、临床分期、影像学疗效评价、Kps评分为患者总生存的影响因素,P<0.05。Kaplan-Meier法单因素生存曲线比较:循环肿瘤细胞数量>5个和≤5个的两组患者,平均生存天数分别为228.10天和339.70天,P=0.000;对ⅢB期和Ⅳ期两组患者,平均生存天数分别为317.92天和270.91天,P=0.000;影像学评价为进展和有效的两组患者,平均生存天数分别为253.42天和328.50天,P=0.000;Kps评分为60分、70分、80分和90分的患者,平均生存天数分别为202.58天、280.78天、307.15天和339.85天,P=0.000。循环肿瘤细胞数量大于5个的患者,中医组和中西医结合组平均生存天数分别为202.93天和253.46天,P=0.125;循环肿瘤细胞数量在5个及以下时,两组平均生存天数分别是334.73天和344.07天,P=0.572;对评价为有效的患者,按照第一周期后循环肿瘤细胞数量分为大于5个和小于等于5个两组,疾病无进展时间均值分别为81.63天和167.42天;中位疾病无进展生存时间分别为为64.00天和172.00天,P=0.000。结论:1.免疫磁珠阴性分选及免疫荧光染色技术对肺癌细胞系A549细胞在每7m1外周血含102以内个细胞时有较高的富集效率、稳定性和特异性。2.该技术检测晚期非小细胞肺癌患者总体循环肿瘤细胞阳性率达79.4%。阳性率只与临床分期相关,而与病理类型、既往治疗、原发灶直径、转移个数、性别、吸烟指数、病理分化程度、辨证分型、功能状态评分均没有明确关系;循环肿瘤细胞数量与临床分期、原发灶大小、病理分化程度及功能状态评分相关,而与病理类型、既往治疗、转移个数、性别、吸烟指数和辨证分型不相关。3.循环肿瘤细胞数量的变化对影像学疗效评价有中等程度的提前预测价值,但是并没有明显优于肿瘤标记物积分的预测价值;在初治、接受中西结合治疗患者中,循环肿瘤细胞数量变化表现出更好的提前预测影像学评价的作用;以循环肿瘤细胞不同的改变量为截点,可相应提高对影像学评价的预测。4.基线循环肿瘤细胞数量、临床分期、影像学疗效评价、Kps评分均为患者总生存的影响因素;循环肿瘤细胞数量>5个、Ⅳ期、影像学评价为进展、Kps评分更低者有更短的总生存时间;基线循环肿瘤细胞数量>5个的患者,接受中西医结合治疗有获得更长生存的趋势,但并无统计学意义;≤5个的患者,中医治疗和中西医结合治疗总生存相似;影像学评价为有效的患者,第一周期后循环肿瘤细胞数量>5个的患者与≤5个的患者相比,有更短的疾病无进展生存时间。