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研究背景胃癌的发病率仍较高,胃癌的诊治仍是肿瘤诊治中面临的挑战之一。早期胃癌诊治效果良好,十年生存率近90%,但国内早期胃癌的检出率仍较低。大部分患者诊断时已经处于中晚期而不得不接受化疗。化疗多年来仍是胃癌治疗的一个比较重要的方法。但胃癌化疗中一个令人沮丧的问题是胃癌细胞对化疗药物的耐药问题,又称为多药耐药(multidrug resistance, MDR)。因此,将胃癌耐药现象作为研究方向,探索其可能的内在机制和寻找对抗肿瘤细胞耐药的干预物将具有很大的价值,为筛选出抗耐药或逆转耐药的药物打下基础。我们在以前的应用免疫组化的方法的研究中观察到在人的胃癌细胞中耐药基因如LRP、GST-π高表达且与COX-2呈正相关。同样ELISA法在体外培养的胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR中,也观察到上述基因对应的蛋白表达被抑制的现象。用COX-2抑制剂塞来昔布能下调这种表达,证实COX-2高表达与上述耐药基因的活性的关系,显示用外来物对耐药基因的干预可能是有效的。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)能诱导某些种类的肿瘤细胞凋亡,还对一些肿瘤细胞有细胞毒作用。近来还发现TRAIL和一些抗肿瘤药物联合应用时表现出协调效应,使耐药或部分耐药的肿瘤细胞变得对药物有敏感性了。TRAIL增加化疗药物杀伤肿瘤细胞的效力的机制何在?是经典的对肿瘤细胞的促凋亡作用、与抗肿瘤药物的协同杀伤肿瘤细胞作用还是通过抑制了肿瘤细胞耐药基因进而逆转肿瘤细胞的耐药性而增强了对肿瘤细胞的杀伤力。通过我们既往的研究结果,我们假设可能是后者即通过抑制肿瘤细胞耐药基因而使肿瘤细胞的耐药性发生逆转。若果真如此,将对解决困扰胃恶性肿瘤化疗的耐药问题提供较好的切入点。因此,本课题分为两个研究部分：第一部分我们采用不同浓度的TRAIL与胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR共同培养,观察TRAIL对耐药基因MDR1,LRP和GST-π有无作用效果,上调还是下调?目的是对TRAIL在耐药基因的调节中扮演的角色进行探索；第二部分我们将TRAIL联合化疗药物顺铂加入胃癌细胞株SGC-7901/VCRTRAIL中,探讨亚毒性剂量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)联合小剂量化疗药物顺铂(DDP)能否协同抑制胃癌细胞株SGC-7901/VCR的活性、提高SGC-7901/VCR的凋亡率和干预其多药耐药基因1(MDR1)勺表达,为进一步走向临床研究打下基础。第一部分：TRAILI对胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR中MDR1, LRP和GST-π耐药基因表达的影响目的：研究TRAIL对胃癌细胞株SGC7901/VCR多药耐药基因MDR1, LRP和GST-π的表达的影响,为最终在临床上使用TRAIL逆转胃癌耐药,解决胃癌细胞多药耐药问题提供初步实验依据。方法：胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR与不同浓度的TRAIL(50,100,200,400ug/L)培养48h,没有任何干预措施的SGC7901/VCR细胞株作为对照,RT-PCR检测各组胃癌耐药细胞株耐药基因MDRl,LRP,GST-π mRNA的表达。同时用ELISA法检测各组胃癌耐药细胞株中三种耐药蛋白P-gp、LRP和GST-π的表达含量：用t检验及单因素方差分析的统计学方法进行分析,研究TRAIL对胃癌耐药细胞株多药耐药基因表达的影响。结果：1. RT-PCR结果：对照组中胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR中的三个耐药基因MDR1,LRP,GST-π均呈阳性,mRNA值分别为0.88±0.01,0.91±0.04和1.01±0.13。胃癌耐药细胞株被四种浓度的TRAIL作用,48h后,胃癌耐药细胞株中的MDR1,LRP,GST-πmRNA的表达被抑制,并随着浓度的增高,抑制效益愈强,但未显示出线性关系。TRAIL组的MDR1mRNA值在四个浓度的实验组均较对照组显著降低(分别为0.78±0.02；0.69±0.05；0.55±0.01和0.53±0.01,与对照组相比,四组均p<0.05)。随着TRAIL的浓度50μ g/L、100μ g/L、200μ g/L递增,MDR1mRNA被抑制幅度有逐渐递增的趋势,各个浓度组之间均显示出显著性差别(P<0.05)。但当浓度增加到400μg/L时,对MDR1mRNA的抑制程度与200μ g/L时对比,无显著性差异(p>0.05)。同样, TRAIL组的LRPmRNA值在50,100,200,400μ g/L四个浓度的实验组均较对照组显著降低,其数值分别是0.85±0.05；0.76±0.05；0.59±0.04和0.58±0.02,全部四种浓度均较对照组显著降低p<0.05)。随着TRAIL的浓度50μg/L、100μ g/L、200μ g/L递增,LRPmRNA被抑制程度有逐渐递增的趋势,各个浓度组之间均显示出显著性差别(P<0.05)。但当浓度增加到400μ g/L时,对LRP mRNA的抑制程度与200μ g/L时对比,亦无显著性差异(p>0.05)。与前两者表现相似的是：TRAIL组的GST-π mRNA值在四个浓度的实验组均较对照组显著降低(分别为0.89±0.04；0.77±0.08；0.65±0.06；0.61±0.03。与对照组相比,四种浓度均显著降低,p<0.05)。随着TRAIL的浓度50μg/L、100μg/L、200μg/L递增,GST-π mRNA被抑制程度有逐渐递增的趋势,各个浓度组之间均显示出显著性差别(P<0.05)。但当浓度增加到400μg/L时,对GST-π mRNA的抑制幅度与200μg/L时对比,无显著性差异(p>0.05)。2. ELISA结果：P-gp, LRP, GST-π蛋白的表达在对照组中分别是49.04±2.07ug/L、119.35±1.04ug/L和58.62±1.38ug/L；与对照组相比浓度为50ug/L的TRAIL组P-gp, LRP和GST-π的含量分别为40.42±1.89ug/L、112.51±1.19ug/L和57.56±1.19ug/L(与对照组相比均p<0.05)。浓度为100ug/L的TRAIL组P-gp,LRP和GST-π的含量分别为36.49±0.94ug/L、106.69±1.51ug/L和52.30±0.80ug/L,也均较对照组显著降低(p<0.05)。同时浓度为100ug/L的TRAIL组与50ug/L TRAIL组相比也显著降低(均p<0.05)。浓度为200ug/LTRAIL组P-gp, LRP, GST-π的对应数值为25.15±0.69ug/L、83.54±2.15ug/L和31.41±1.65ug/L,比对照组显著降低(p<0.05)。与浓度为100ug/L TRAIL组相比也显著降低(均p<0.05)。浓度400ug/L TRAIL组P-gp, LRP, GST-π的水平相应是24.45±1.41ug/L、82.63±1.35ug/L、30.80±1.34ug/L,与对照组、50ug/L TRAIL组、100ug/L TRAIL组比较,均显著降低(p<0.05；)。然而浓度400ug/L TRAIL组与200ug/L TRAIL组比较,P-gp, LRP和GST-π的降低并无显著性差异(p>0.05)。结论：1. MDR1, LRP, GST-π在胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR均有表达。2.在四种浓度的TRAIL的干预下,SGC7901/VCR中耐药基因MDR1、LRP和GST-π的表达均较对照组显著下降且下降幅度与浓度有关。3. TRAIL除了促进肿瘤细胞的凋亡作用,它还可能通过降低肿瘤耐药细胞株中耐药基因MDR1, LRP, GST-π在的表达而降低胃癌的耐药,增强化疗药物的疗效。论文第二部分：TRAIL联合顺铂杀伤胃癌细胞株SGC-7901/VCR和对耐药基因MDR1表达的干预研究目的：探讨肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)和小剂量化疗药物顺铂(DDP)对胃癌细胞株SGC-7901/VCR的活性和联合应用对多药耐药基因1(MDR1)的影响。方法：运用MTT法检测不同浓度的TRAIL和顺铂对胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR的活性或增殖的影响。筛选出TRAIL及顺铂的亚毒性剂量。采用流式细胞术检测TRAIL(?)(?)顺铂的亚毒性剂量下单用及联合应用后的细胞凋亡率。TRAIL和顺铂联合应用后,用RT-PCR技术检测胃癌耐药细胞株耐药基因MDR1mRNA(?)的表达。同时用ELISA法检测耐药蛋白P-gp(?)勺表达含量,研究TRAIL对胃癌耐药细胞株多药耐药基因表达的影响。结果：1.MTT法检测药物对SGC-7901/VCR细胞活力的影响的结果显示：顺铂和TRAIL都可一定程度上杀伤胃癌耐药细胞SGC-7901/VCR,随着药物浓度的增加,细胞活力下降。经计算48h顺铂的IC10(活性抑制10%)为0.535g/L,以MTT结果选取200μg/L作为TRAIL浓度较合适。流式细胞术结果显示对照组、顺铂组、TRAIL组、TRAIL顺铂联合用药组中,作用48h后胃癌细胞凋亡率以联合用药组细胞凋亡显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.RT-PCR结果：对照组中胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR的耐药基因MDR1呈阳性。胃癌耐药细胞株被TRAIL和顺铂联合作用48小时后,胃癌耐药细胞株中的MDR1mRNA的表达被抑制,较对照组显著降低(p<0.05)。联合用药组细胞凋亡明显升高,与对照及单药组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3. ELISA法结果：与单药组比较,联合用药组协同作用明显,P-gp蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)结论：1.胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR中耐药基因MDR1高表达,MDR1是胃癌多药耐药的耐药基因。2. TRAIL与顺铂联合具有协同抑制胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR活性、显著增加凋亡率,下调MDR1基因和P-gp蛋白表达的作用。3.推测TRAIL与顺铂协同杀伤胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR的机制可能是通过抑制MDR1基因的表达从而逆转胃癌细胞的多药耐药实现的。