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胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康和生命。随着社会经济发展与生活水平的提高,在欧美等发达国家其发病率和死亡率呈明显下降趋势,然而在亚洲、拉丁美洲仍然高发。由于其发病机制非常复杂,其预后仍不容乐观。二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是大蒜中的脂溶性有效成分,可抑制多种肿瘤发生发展。我们前期研究证实,DADS能在体内外抑制人胃癌细胞增殖,其机制与G2/M期阻滞、p38激活、ERK抑制及其他多条信号转导通路异常有关。MicroRNAs是一类小分子非编码RNA,近年研究表明,其与胃癌的关系密切,参与胃癌的发生发展,在胃癌的增殖、侵袭和转移等过程中发挥了重要作用。miR-7是23个核苷酸miRNA,在多种肿瘤中低表达,具有潜在的抑瘤功能。XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)作为凋亡抑制因子家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成员之一,在肿瘤发生发展中起着癌基因作用,与肿瘤发生、发展、凋亡、迁移、侵袭和转移密切相关。我们前期采用mirna芯片技术筛选dads处理人胃癌细胞的差异mirna表达,发现dads处理后人胃癌细胞mir-7明显上调。同时,qrt-pcr验证mir-7在胃癌组织与胃癌细胞株中显著下调。蛋白质组学发现xiap等24种差异表达的蛋白质,并验证显示,多株人胃癌细胞xiap高表达,而dads处理胃癌细胞后,xiap明显下调。本实验分三部分探讨mir-7和xiap对人胃癌细胞增殖侵袭的影响及二者相互关系。第一部分:dads上调mir-7抑制人胃癌细胞增殖和侵袭目的:探讨dads和mir-7对人胃癌细胞增殖和侵袭的影响。方法:构建mir-7高表达和沉默病毒载体,通过细胞转染,建立mir-7稳定高表达和沉默的sgc-7901和hgc-27细胞系,同时各组细胞经30mg/ldads处理,然后采用qrt-pcr、cck-8、平板克隆、流式细胞术、划痕实验、迁移实验、侵袭实验和裸鼠移植等分析dads和mir-7对胃癌细胞增殖和侵袭的作用。结果:qrt-pcr证实成功构建mir-7稳定高表达和沉默的sgc-7901和hgc-27细胞系,且dads能上调各组细胞mir-7的表达。dads和mir-7高表达分别可显著抑制sgc-7901和hgc-27细胞增殖,诱导sgc-7901细胞凋亡和细胞周期阻滞,抑制sgc-7901细胞克隆形成。划痕实验和transwell迁移和侵袭实验表明,dads和mir-7高表达分别可显著抑制sgc-7901和hgc-27细胞迁移和侵袭能力。裸鼠成瘤实验也表明dads组和mir-7高表达组肿瘤生长较慢,瘤体较小,较对照组有显著性差异(p<0.05)。而mir-7沉默后表现出与mir-7高表达相反的结果。各组实验均表明,mir-7高表达可协同dads抑制细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、移植瘤生长,诱导细胞凋亡和周期阻滞,反之,mir-7沉默可拮抗dads的作用。第二部分:dads下调xiap抑制人胃癌细胞增殖和侵袭目的:探讨dads和xiap对人胃癌细胞增殖和侵袭的影响。方法:免疫组织化学检测组织芯片中胃癌组织xiap的表达情况,构建xiap高表达病毒载体和沉默质粒,通过细胞转染,建立xiap稳定高表达和沉默的sgc-7901和hgc-27细胞系,同时各组细胞分别经30mg/ldads处理,然后采用qrt-pcr、westernblot、细胞免疫荧光、cck-8、平板克隆、流式细胞术、划痕实验、迁移实验、侵袭实验以及裸鼠移植等分析dads和xiap对人胃癌细胞增殖和侵袭的作用。结果:xiap在胃癌中呈强阳性表达,阳性部位主要在细胞质中,而正常上皮及不典型增生上皮呈阴性或部分阳性表达,阳性表达率差异具有统计学意义(p<0.05)。qrt-pcr证实成功构建xiap稳定高表达和沉默的sgc-7901和hgc-27细胞系,且dads能下调各组细胞xiap的表达。westernblot实验也表明xiap沉默的sgc-7901和hgc-27细胞xiap表达下降,而xiap高表达组则xiap表达上升,dads可使各组xiap表达均下降。细胞免疫荧光亦发现,xiap阳性表达主要在细胞质中,xiap表达水平与westernblot实验一致。dads和xiap沉默分别可显著抑制sgc-7901和hgc-27细胞增殖,诱导sgc-7901细胞凋亡和细胞周期阻滞,抑制sgc-7901细胞克隆形成。划痕实验和transwell迁移和侵袭实验表明,dads和xiap沉默可分别显著抑制sgc-7901和hgc-27细胞迁移和侵袭能力。裸鼠成瘤实验也表明dads组和xiap沉默组肿瘤生长较慢,肿瘤瘤体较小,较对照组有显著性差异(p<0.05)。这些实验结果与mir-7高表达一致,而xiap高表达后表现出与xiap沉默相反的结果。而且,各组实验均表明,xiap沉默可协同dads抑制细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期阻滞以及抑制移植瘤生长的作用,同时,亦可拮抗xiap过表达的作用。第三部分:mir-7靶向负性调控xiap的表达目的:探讨mir-7和xiap的靶向关系。方法:从mirnabase数据库查找成熟mir-7序列,同时从genbank查询xiap3’utr序列;利用在线数据库diana-microt-cds、targetscan和miranda进行靶基因预测,然后构建包含xiap-3’utr-wt和xiap-3’utr-mt双荧光素酶报告基因系统,与mir-7高表达载体共转染sgc-7901细胞,检测荧光素酶报告基因活性;最后通过qrt-pcr和westernblot检查mir-7稳定高表达和沉默的sgc-7901和hgc-27细胞xiapmrna和蛋白的表达,最终确定mir-7与xiap的靶向关系。结果:在获取miR-7成熟序列和XIAP 3’UTR序列基础上,利用生物信息学分析发现miR-7与XIAP 3’UTR存在多个结合位点,三个在线软件均预测XIAP为miR-7的靶基因之一;双荧光素酶报告基因系统证实miR-7与XIAP 3’UTR野生型共转染SGC-7901细胞,其荧光值与对照组比较,明显下降;miR-7稳定高表达的SGC-7901和HGC-27细胞XIAP mRNA和蛋白表达水平均下调,反向实验验证miR-7稳定沉默的SGC-7901和HGC-27细胞XIAP mRNA和蛋白水平均上调。结论:1.DADS可上调miR-7抑制人胃癌细胞增殖、迁移侵袭与移植瘤生长和诱导凋亡与周期阻滞。2.DADS可下调XIAP抑制人胃癌细胞增殖、迁移侵袭与移植瘤生长和诱导凋亡与周期阻滞。3.miR-7靶向负性调控XIAP mRNA和蛋白的表达。