子宫内膜作为卵巢甾体激素调控的靶组织,其在性激素的周期性作用下发生着由增殖、分化到崩解、修复的周期性变化。任何一个环节的障碍将导致整个月经周期发生病理性改变,这也使得月经性疾病严重的影响着女性的生理和心理健康。规律的子宫内膜周期性变化与卵泡的发育在生殖上具有重要意义。子宫内膜的因素也是体外受精-胚胎移植技术(In vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)失败的关键。整个子宫内膜的变化规律体现了月经的运行机制,目前对月经机制的研究还有诸多问题悬而未解,模式动物的缺少也使得研究的深入陷入了瓶颈。本课题组引入了小鼠月经样出血模型,研究月经周期用药的方法对子宫内膜变化的干预情况。为临床上治疗包括子宫内膜容受性降低、功能性子宫出血等疾病奠定理论基础。针对小鼠月经样出血模型的基础医学研究包括子宫角的蜕膜化状态,血清中激素的变化,炎性因子的表达,血管的变化,崩解相关的调控因子(Matrix Metallo Preteinases,MMP)表达的变化,以及核转录因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)等多种途径参与了内膜组织胞外基质的降解,即子宫内膜的剥脱、出血。本研究在成功复制小鼠月经样出血模型的基础上首次用中药进行干预,观察周期用药对子宫内膜不同时期的影响。检测子宫的外观形态变化;子宫系数;阴道细胞涂片检测红细胞变化;放射免疫法检测血清中雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,P)水平的变化;免疫组化、蛋白免疫印迹法(Western blot)、实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time polymerase Chain Reaction,Real-time PCR)法检测子宫内膜组织在增殖与分泌期的雌激素受体(estradiol receptorα,ER-α)、孕酮受体(progesterone receptor,PR),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR2)的变化;观察月经期即子宫内膜的崩解期MMP3、MMP9以及NF-κB中P50与P65质蛋白、核蛋白的表达变化。以子宫内膜的不同时期为界,从组织、分子、基因水平研究调理肝肾周期用药对子宫内膜的作用机制。第一部分调理肝肾周期用药的探讨目的:研究调理肝肾周期用药的理论基础,分期原则,组方原则以及本研究所用方剂、应用方法的基源。方法:中医学的月经是“肾气-天癸-冲任-胞宫”的机制与现代医学的神经内分泌系统即下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamus-pituitary-ovary axis,H-P-O axis)的调节子宫内膜的周期性变化是相对应的。根据月经周期性变化的特点对月经性疾病的治疗的意义在于能够明确的调整子宫内膜的状态,使其顺应增殖、分化、崩解和修复的周期性变化规律。这也是中医的“因时制宜”以及辨病与辨证相结合原则的体现。“肾主生殖,为先天之本”、“女子以肝为先天”与“女子以血为本”等理论在女性的生理、生殖上均起着关键的作用,调理肝肾法即以“期”为原则,通过辨病、辨证、辨时用药体现“调经可以妊子,调经可以却疾”的临床意义。结论:依据月经周期性变化的特点提出了调理肝肾周期用药,对月经性疾病的治疗具有重要的临床与科研意义。第二部分调理肝肾周期用药对月经样出血模型小鼠子宫形态学影响目的:观察调理肝肾周期用药对小鼠的子宫角外观、子宫系数、子宫内膜形态学等影响,以探讨周期用药对子宫内膜增殖、分泌、崩解的周期性变化影响。方法：1动物分组与模型复制:200只SPF级雌性未孕C57BL/6J小鼠,8~10周龄,体重18~20g,随机分为假手术组(Sham group)40只、对照组(Control group)80只、中药组(TCM group)80只。除假手术组外的对照组与中药组小鼠复制月经样出血模型,小鼠切除卵巢后进行激素序贯处理:第1~3天09:30皮下注射100ng/d E2;第4~6天无处理;第7天将孕酮皮下埋植剂植入小鼠颈背部皮肤松弛处,同时皮下注射50ng/d的P和5ng/d的E2;第8~9天09:30皮下注射5ng/d E2;第9天11:30,小鼠麻醉下开腹于左侧宫腔注射20μL无菌花生油,用以诱导蜕膜化,右侧做自身对照。49h后将小鼠颈背部的埋植剂取出,以此时间为0h时间点。假手术组仅开腹、关腹,但不切除卵巢,且假手术组只对模型建立的成功与否检验相关指标。2给药方法:按调理肝肾周期用药的原则,中药组于第1~4天给灌胃补肾方,5~9天给灌胃调肝方,第9~12天给灌胃活血方,每天1次,给药量每次0.2ml/10g。3取材点设计:分别于激素处理的第4天处死小鼠,为T1点;第9天处死为T2点;在孕酮撤退的0h、8h、12h、16h、24h、32h处死小鼠。4指标检测:观察小鼠的一般情况、子宫角的外观形态、阴道细胞学涂片、测量子宫系数、将子宫角横切面进行H&E染色,观察组织学变化。结果:(1)小鼠一般状况:小鼠手术创面恢复良好,精神状态佳,反应灵敏,毛色有光泽,每日进食、水量稳定,激素给予前后小鼠体重稳定。开腹后,子宫角结扎处未见明显的炎性反应,子宫角状态良好。(2)子宫角外观形态:随时间的变化,假手术小鼠的子宫角外观未见明显改变;对照组实验侧在单纯E2作用下的T1点,肉眼下可见小鼠子宫角肿大,内有液体充盈,外周血管密集、清晰可见;在E2、P联合作用下的T2点,整个子宫体呈现红色,而管腔未见明显肿大;0h点,实验侧子宫角呈现淡红色,管腔增粗肿大,8h点与0h相比,变化不明显,到16h实验侧子宫角颜色加深呈暗红色,管腔明显增粗肿胀,24 h到32h,实验侧子宫角充血的颜色现暗紫色,管腔肿胀的程度减低。与对照组同时间点相比,中药组实验侧子宫角呈现相似的变化趋势,但在时间点的变化上与对照组有明显差异,0h的变化与对照组的8h相似,12h管腔肿胀的程度最明显,且整个出血过程明显缩短,32h点实验侧子宫角明显呈现修复的改变。(3)阴道细胞涂片情况:随时间变化,假手术组未检出红细胞;0、8h对照组没有检测到红细胞,从12h阳性小鼠的比率增加,24h达87.5%,32h为88.9%,涂片的红细胞数量24h最高;中药组在0h即有红细胞存在,16h、24h到达87.5%、77.8%,32h明显下降,涂片的红细胞数量16h为最高点,与对照组比较子宫内膜崩解的速度明显增加,时程也明显缩短。(4)子宫系数变化:与假手术组同时间点比较,对照组在T1-T2点两侧子宫系数均显著性增加(P<0.05),蜕膜化后0h-32h左侧(实验侧)子宫系数显著性增加(P<0.05),右侧(对照侧)子宫系数无明显差异(P>0.05);在蜕膜化后0h-32h的各个时间点,对照组与中药组左侧比右侧明显增加(P<0.05);对照组在16h到最高值,中药组的最高值在12h;与对照组比较,中药组左侧子宫系数在T1-12h显著增加(P<0.05),在32h则明显减小(P<0.05)。(5)子宫组织形态学变化:随时间的变化,假手术组小鼠子宫角在整个过程中上皮完整,功能层细胞排列紧密,间质细胞无明显变化,说明未发生蜕膜化样改变。在E2作用下T1点,子宫内膜呈单层上皮结构,核质较高,细胞核呈椭圆状,基质疏松。而在E2、P联合作用下的T2点,内膜呈假复层改变,见分泌细胞,与模组性比较,中药组小鼠的子宫内膜变化更明显。孕酮撤退后,在0h子宫腔由于间质细胞蜕膜化内膜增厚使宫腔狭窄,细胞肥大,胞浆红染;8h则近宫腔处间质蜕膜细胞体积缩小,胞质致密、嗜酸性染色增强,核固缩,染色质致密;12h到16h,间质中有白细胞浸润,蜕膜化间质坏死并伴有出血;24 h到32h,脱落的间质细胞呈坏死变化,较多白细胞浸润,大量的坏死组织涌现,子宫内膜崩解脱落。中药组实验侧的子宫组织变化趋势与对照组相似,但在时间点的变化上与对照组有明显差异,0h的变化与对照组的8h相似,且胞浆大量红染,12h的出血量最多,16h崩解的内膜与基底层的界限清晰,32h则呈现腔上皮有乳头状增生,内膜层有明显的修复变化。(6)子宫内膜崩解时程变化:与对照组比较,中药组小鼠子宫各参数表现出与对照组相似的变化趋势,但中药组的峰值比对照组提前了4 h,且32h时间点观察到有明显的内膜修复特征,说明活血方能够明显的缩短子宫内膜的崩解时程。结论:周期用药中补肾方能够明显促进子宫内膜在增殖期的增殖变化;调肝方能够促进子宫内膜向分泌期的转化;活血方能够加速子宫内膜的剥脱,并明显缩短崩解时程。第三部分调理肝肾周期用药对其增殖期、分泌期子宫内膜E2、P、VEGF及其受体的影响目的:通过观察激素(E2、P)、受体(ER-α、PR)以及血管内皮生长因子(VEGF/VEGFR2)的变化研究周期用药中补肾方、调肝方对子宫内膜增值与分化作用的相关性。方法:动物分组、模型复制同第二部分,给药为补肾方与调肝方。采用放射免疫法测定血清中E2、P的含量,免疫组化、蛋白免疫印迹法(Western blot)与Real-time PCR方法检测子宫组织ER-α、PR、VEGF/VEGFR2蛋白与m RNA的表达。结果:(1)血清中E2、P的含量比较:与假手术比较,对照组血清中E2、P的含量均显著性升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,中药组血清中E2、P的含量增加,但没有显著性差异(P>0.05)。(2)免疫组化检测ER-α、PR、VEGF/VEGFR2表达的变化:ER-α的阳性信号位于间质细胞的细胞质中:在T1点只间质细胞的细胞质有弱表达,T2点在腺上皮细胞与间质细胞表达增强;PR的阳性信号在T1点间质细胞的细胞质、核中有较弱表达,T2点在上皮细胞有表达;VEGF的阳性信号于腺上皮、腔上皮间质细胞表达,在T1点与T2点均较强;VEGFR2的阳性信号于T1点腺上皮有表达,T2点在腺上皮、腔上皮间质细胞均有表达。与对照组比较,中药组的表达范围与强度均明显增强。(3)Western blot检测ER-α、PR、VEGF/VEGFR2蛋白表达比较:对照组ER-α的蛋白表达T2点低于T1点;PR与VEGF的蛋白表达T2点显著高于T1点(P<0.05);VEGFR2的蛋白表达T2点显著低于T1点(P<0.05);与对照组同时间点比较,中药组的表达均显著上调(P<0.05)。(4)Real-time PCR检测ER-α、PR、VEGF/VEGFR2 m RNA的比较:与假手术组比较,对照组子宫组织中ER-αm RNA、PR m RNA、VEGF/VEGFR2 m RNA的表达均呈显著性增强(P<0.05)。对照组ER-αm RNA的表达T2点低于T1点;PR m RNA与VEGF m RNA表达T2点显著高于T1点;VEGFR2 m RNA的表达T2点显著低于T1点;与对照组同时间点比较,中药组的表达均显著上调(P<0.05)。结论:补肾方、调肝方分别调节了子宫内膜增殖期、分泌期的状态和功能,其机制并不是单纯的增加血清激素的含量,而可能是上调了组织中ER-α、PR与VEGF/VEGFR2的表达。第四部分调理肝肾周期用药中活血方对月经期崩解因子MMP3、MMP9表达时相的影响目的:通过观察MMP3与MMP9的表达时相变化,探讨周期用药中活血方对子宫内膜崩解时程影响的作用机制。方法:动物分组、模型复制同第二部分,给药为活血方。采用免疫组化、Western blot与Real-time PCR方法检测子宫组织MMP3、MMP9蛋白与m RNA的表达。结果:(1)免疫组化检测MMP3、MMP9表达比较:孕酮撤退后,随时间变化对照组与中药组小鼠子宫组织MMP3、MMP9有阳性表达。MMP3在蜕膜化的胞外基质、基底层的基质细胞以及腺上皮均有明显的阳性信号表达,随时间的延长,蜕膜化基质细胞的外延,阳性信号渐强,表达峰值在16h;在24h与32h,子宫内膜出现大面积的剥脱,阳性信号在脱落的内膜基质细胞的胞外基质也有表达。MMP9的阳性信号主要定位在蜕膜化的间质细胞,在孕酮撤退的0h,表达较弱,随时间延长,表达的强度渐强;在16h,子宫内膜大部分崩解,在蜕膜化区域与基底层均有较强的阳性信号表达。与对照组的同时间点比较,中药组的表达范围与强度在0h-16h明显增强,12h时间点的表达最强,随之表达的强度渐弱,32h明显减弱。(2)Western blot检测MMP3、MMP9表达的比较:与0h比较,对照组MMP3蛋白的表达在8h-16h明显上调(P<0.05),32h显著下调(P<0.05),16h到达峰值;与0h比较,中药组在8h-16h明显上调(P<0.05),32h显著下调(P<0.05),12h到达峰值。与0h比较,MMP9蛋白的表达在8h-32h明显上调(P<0.01),16h到达峰值;与0h比较,中药组在8h-16h明显上调(P<0.01),32h显著下调(P<0.01),12h到达峰值。表明MMP参与子宫内膜崩解脱落、出血。中药则是表达的时间提前4h,并有一个明显的回落过程,加速了内膜的崩解。(3)Real-time PCR检测MMP3 m RNA、MMP9 m RNA表达的比较:对照组8h-32h的表达量明显高于0h(P<0.05),在24h到达峰值;与对照组的同时间点比较,中药组的表达量在0h-16h显著高于对照组(P<0.05),最高值点在12h,32h时间点则明显低于对照组(P<0.05)。结论:活血方在子宫内膜崩解前期(12h)使MMP3、MMP9的表达明显上调,表达的峰值提前;而在崩解后期与修复早期(24h-32h),则又使其表达下调,从而缩短了子宫内膜的崩解时程。第五部分调理肝肾周期用药中活血方对月经期信号通路NF-κB表达的目的:通过观察NF-κB中p50与p65核蛋白的表达变化,探讨周期用药中活血方对NF-κB通路活化与阻断的调控机制。方法:动物分组、模型复制同第二部分,给药为活血方。采用免疫组化、Western blot检测子宫组织P50与P65核蛋白与质蛋白的表达。结果:(1)免疫组化检测P50、P65表达的比较:对照组在孕酮撤退的0h,P50与P65均定位在蜕膜化区域间质细胞的细胞浆内,到16h二者则定位在细胞核内,说明在0h,NF-κB的信号通路处于未激活状态,16h即被激活;中药组的0h二者在蜕膜化区域间质细胞的细胞核内即有表达,8h又定位在细胞浆,12h细胞核表达较强,24h则仅在细胞浆内表达,说明NF-κB的信号通路开始被激活,随后又一个缓冲,后又处于较强的激活状态,最后又及时关闭。(2)Western blot检测P50、P65表达的比较:孕酮撤退后,P50核蛋白:对照组在8h-32h的表达明显高于0h(P<0.01);中药组P50的核蛋白在0h即有一个高表达,12h比0h显著性上调(P<0.05),而在24h与32h点则显著降低(P<0.01);P65的核蛋白:对照组在12h、16h表达比0h显著上调(P<0.05),其余点变化不大;中药组在0h有一个高表达,与0h比较,在8h,24h降低(P<0.05),32h表达则显著降低(P<0.01)。结论:活血方通过调节P50与P65入核与出核,达到迅速激活或阻断信号通路NF-κB的作用,进而使子宫内膜能够快速、完全的脱落并利于内膜的修复。