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目的：
1.将抗erbB2的单链抗体可变区基因与人IgGlFc段基因、CD28跨膜区基因和CD3(ζ)链基因相连接，从而形成anti-elbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)融合基因，并将该融合基因连接到逆转录病毒表达载体pLNCX上，构建表达质粒pLNCX/anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)。
2.将表达质粒转染T细胞株Jurkat，使融合基因anti-erbB2scFv-Fc-CD28.CD3(ζ)表达于细胞膜上。
即针对erbB2过表达肿瘤，构建含融合基因anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的T细胞，为erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。
方法：
1.融合基因蛋白质结构预测已知融合基因各片段DNA标准序列，由此可知其氨基酸标准序列，故可将各片段组合形成融合基因编码的氨基酸序列，利用SWISSMODEL和PHYRE(ProteinHomology/analogYRecognitionEngine)预测该融合蛋白的二、三级结构。
2.融合基因片段的扩增、连接及表达质粒的构建用高保真：DNA聚合酶即PyrobestDNA聚合酶，应用PCR方法从重组质粒pBullet上扩增片段signal(以下均简称S)和片段Fc-CD28-CD3(ζ)(以下均简称B)，从重组质粒pPIC9K上扩增片段anti-erbB2scFv(以下均简称A)。再经过两次SOE-PCR构建融合基因signal-anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)(以下均简称S-A-B)，利用TA克隆方法将融合基因克隆到pMD19-Tsimple载体上，再将该重组克隆质粒转化到大肠杆菌E.coliDH-5α感受态细胞中扩增并保存。
分别对构建好的pMD19-TSimple重组克隆质粒和逆转录病毒表达载体pLNCX，用限制性内切酶HindⅢ和ClaⅠ进行双酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化融合基因片段和pLNCX载体片段，利用T4连接酶连接。将连接产物转化到E.coliDH-5α感受态细胞中，并应用带氨苄青霉素抗性的LB固体培养基筛选，挑取单个阳性菌落，LB液体培养基培养后，提取纯化质粒，进行琼脂糖凝胶电泳、PCR、测序鉴定。
3.转染人T淋巴瘤细胞株Jurkat并检测融合基因表达情况应用脂质体转染试剂盒将重组表达质粒PLNCX/S-A-B转染至Jurkat细胞株，先应用流式细胞术检测融合基因瞬时表达情况，然后用含800μg/mLG418的RPMI1640培养液筛选转染阳性Jurkat细胞株，筛选后应用流式细胞术检测融合基因表达情况。
结果：
1.融合基因蛋白质结构预测对融合基因进行蛋白质二、三级结构预测结果，该融合基因所表达的蛋白质在二级结构和三级结构上可以形成功能构象。
2.融合基因片段S、A、B的扩增、连接及表达质粒pLNCX/S-A-B的构建经PCR法以pBullet为模板扩增出S片段和B片段，以pPIC9K为模板扩增出A片段。通过第一次SOE-PCR使S片段与A片段相连接，通过第二次SOE-PCR使S-A片段与B片段相连接形成融合基因S-A-B。将所得融合基因S-A-B与T克隆载体相连，得到重组克隆质粒pMD19-TSimple/S-A-B，经测序鉴定序列正确。
重组克隆质粒pMD19-TSimple/S-A-B及逆转录病毒表达载体pLNCX经双酶切，连接得到重组表达质粒pLNCX/S-A-B，转化，筛选，经PCR及测序鉴定，证实表达质粒pLNCX/S-A-B构建正确。
3.转染T细胞株及融合基因的表达检测重组表达质粒PLNCX/S-A-B瞬时转染人淋巴瘤T细胞株Jurkat，在转染36h后能够检测到融合蛋白的表达。转染后用G418筛选14d，经流式细胞术检测，融合蛋白表达量达23.68％。
结论：
本文应用分子克隆的方法成功地构建了真核表达质粒pLNCX/S-A-B，并对其进行了序列鉴定和初步的真核表达检测，证实了重组表达质粒构建的正确性，且表达量较高，为进一步进行肿瘤基因靶向治疗的实验研究奠定基础。