研究背景及意义胶质瘤(Glioma)约占成人颅内肿瘤的46%,在1998年世界卫生组织(WorldHealth Organization,简称：WHO)公布的疾病致死率排位中,恶性胶质瘤是34岁以下(含34岁)肿瘤患者的第2位致死原因,是35岁至54岁肿瘤患者的第3位致死原因。在最新的WHO肿瘤分级系统中,根据胶质瘤细胞的非典型性、核分裂指数以及内皮细胞增殖情况和坏死程度,将胶质瘤分为4级：Ⅰ级,一般以良性为主,多为毛细胞型星形细胞瘤,占胶质瘤5%左右,是可以治愈的；Ⅱ级,为一般的星形细胞瘤或星形-少突细胞瘤,约占胶质瘤的30～40%；Ⅲ级,为间变型星形细胞瘤,大约占胶质瘤的15～25%；ⅣV级,为多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,简称GBM),约占胶质瘤的30%。GBM是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤,在美国的年发病率为3.19/10万人。GBM通常位于大脑皮质下,呈浸润性生长,常同时侵犯多个脑叶和深部结构,还可以越过胼胝体侵犯对侧大脑半球,其最常发生的部位为额叶。GBM生长速度快,周围脑水肿广泛,颅内压增高症状明显,患者症状重,预后很差,目前即使采用标准的术后替莫唑胺化疗加辅助化疗进行治疗,其5年生存率仍不足10%。70%-80%的GBM患者病程在3至6个月,病程超过1年者仅10%。到目前为止,GBM确切的病因和发病机制并未完全阐明,是神经外科亟待解决的难题之一。近年来,对胶质母细胞瘤发病机制的研究取得了较大的进展。例如,在基因水平,肿瘤抑制基因p53的缺失或突变、磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensinhomolog, PTEN)突变；在转录组学水平,小RNA(MicroRNA,如miR-124)和长链非编码RNA (LncRNA,如HOTAIR)的异常表达；在表观遗传学水平,06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子的异常甲基化；在信号通路水平,表皮生长因子受体(EGFR)的过量表达、PI3K/Akt、MAPK、STAT、mTOR等信号通路的异常活化等,这些研究使得研究者对GBM发病机制的了解愈发清晰,为个体化的治疗提供了可能,有助于判断肿瘤的发生发展及预后。然而对于GBM的发病机制,目前仍有很多未知的细节。细胞周期蛋白依赖性激酶亚基CKS(cyclin-dependent kinase subunit)是一种普遍存在于真核生物体内的小分子蛋白家族,它们的相对分子质量约为9～18KDa,作为CDK的构成部分参与细胞分裂周期的调节过程。目前研究发现,人类细胞中存在两种CKS(又称CKSHS)蛋白,分别为CKS 1 (cyclin-dependent kinase subunit 1)和CKS 2 (Cyclin dependent kinase subunit 2)。其中,CKS2是一个由79个氨基酸组成的分子量为9KD的蛋白,其基因位于人类染色体9q22上,在多种恶性肿瘤中存在异常表达,参与肿瘤的发病过程。目前的研究发现,CKS2在结直肠癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、食管癌和胆管癌中都存在异常表达,并与这些恶性肿瘤的起病、进展和转移等生物学行为密切相关,因此,CKS2蛋白作为一种新型的肿瘤标志物正引起越来越多研究者的兴趣。但关于CKS2在胶质母细胞瘤中的的研究鲜有文献报道。本研究以胶质母细胞瘤的肿瘤组织标本和细胞系为研究对象,通过分子细胞生物学技术,探究CKS2在GBM中的表达及其与胶质母细胞瘤临床病理参数的相关性,并初步探究CKS2对GBM细胞系生物学行为的影响以及其调控信号通路的机制,为进一步探究CKS2在GBM病中的作用奠定基础。本研究共分为三部分。第一部分,收集山东大学附属省立医院2010年到2013年共计65例胶质母细胞瘤患者和30例颅脑外伤病人正常脑组织的手术标本及临床资料。应用免疫组化染色、Real-time PCR和Western blot技术探究CKS2在GBM肿瘤组织中的表达,及其与临床病理参数和预后的相关性。第二部分,采用shRNA技术干扰人GBM细胞系U87/U251中CKS2的表达,观察干扰CKS2基因对U87/U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。第三部分,采用shRNA技术干扰U87/U251细胞株中CKS2基因的表达,使用Western blot技术检测PI3K/AKT/mTOR通路关键蛋白(AKT和mTO R)和MAPK通路关键蛋白(ERK1/2)的磷酸化水平,探究CKS2在GBM中发挥作用的信号通路。第一部分 CKS2在正常脑组织和胶质母细胞瘤中的表达及其临床意义研究目的：1、探究CKS2 mRNA和蛋白在正常脑组织和胶质母细胞瘤中表达水平的差异。2、探究CKS2异常表达与胶质瘤患者临床病理学参数及预后等其他因素的相关性。研究方法：1、标本收集：我们收集了山东大学附属省立医院2010到2013年的共计70例胶质母细胞瘤患者的病理和临床资料,并且通过电话随访的方式获得了患者的术后生存资料和辅助治疗情况。在患者及其家属知情同意基础上,我们选取65例胶质母细胞瘤患者的手术切除标本及30例颅脑外伤病人健康脑组织标本,将标本一分为二,一份10%中性甲醛固定,另一份液氮中冻存。患者的入组标准为：(1)KPS评分>70分；(2)所有患者这在本次发病之前均未接受过放疗、伽马刀治疗、化疗、中医中药治疗或其他类型的系统治疗。(3)患者同意参与本项研究,并签署知情同意书。2、免疫组织化学技术检测CKS2的表达：将10%中性甲醛固定的标本脱水浸蜡、石蜡包埋后制做成蜡块,4μm厚度连续切片,将切片脱蜡,柠檬酸钠(pH=6.0)高压抗原修复2min,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,滴加兔抗人CKS2抗体(浓度1：200),4℃孵育过夜,二抗采用PV-9000试剂盒,严格按照试剂盒说明书步骤进行,然后DAB显色,显微镜下控制显色程度,水终止显色反应,苏木素染液复染,脱水透明后中性树胶封片,显微镜下观察,选取5个高倍视野摄片并进行结果处理。3、CKS2的表达水平与临床病理等参数间的相关性分析：免疫组化法检测增殖相关核抗原Ki67的表达,并计算Ki67指数。SPSS 21.0软件分析胶质母细胞瘤中CKS2的表达水平与Ki67指数、性别、年龄、辅助治疗以及切除程度之间的Spearman相关性。4、Real-Time PCR技术检测胶质母细胞瘤中CKS2 mRNA的表达水平：取液氮中冻存的组织标本100mg,按Trizol试剂说明书步骤提取总RNA,微量分光光度计检测总RNA的浓度和质量；然后将总RNA反转录为cDNA,使用SYBR Green法进行real-time PCR检测,所得数据用2-△△Ct法进行分析。5、Western b lot技术检测胶质母细胞瘤中CKS2蛋白的表达水平：取液氮中冻存的组织标本100mg,在组织匀浆器中破碎,加入RIPA裂解液冰上裂解30min,离心后取上清,BCA法测定蛋白浓度,、Western blot检测CKS2蛋白的表达。研究结果：1、患者一般情况：65例胶质母细胞瘤患者,平均年龄51.1岁。其中男37例,女28例,手术切除情况和辅助治疗情况详见论文第一部分表格1。2、CKS2主要在正常脑组织和胶质母细胞瘤细胞核表达,呈黄色至棕黄色颗粒状沉积,与健康脑组织相比,CKS2在GBM中表达明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、胶质母细胞瘤中CKS2的表达与Ki67指数呈正相关(r=0.323,P<0.05),与年龄、性别、切除程度以及辅助治疗情况无相关性。4、预后分析：Kaplan-Meier分析显示存在CKS2过表达的GBM病人预后比不存在CKS2过表达的GBM病人预后要差(Log Rank Chi-square=13.518, P<0.05)。Cox比例风险模型分析表明CKS2过表达是GBM病人的独立预后因素(Risk ratio, RR=2.627, P<0.05)。5、Western Blot结果证明CKS2蛋白在GBM组织中的表达明显高于健康对照脑组织,差异有统计学意义(P<0.05); RT-PCR结果证明CKS2 mRNA在GBM中的表达水平明显高于正常脑组织,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：CKS2主要在正常脑组织和GBM的肿瘤细胞胞核中表达；CKS2 mRNA和蛋白的表达水平与健康对照脑组织组相比明显上调；CKS2蛋白的表达程度与肿瘤细胞的增殖相关核抗原Ki67的表达呈正相关；预后分析显示CKS2过表达是GBM患者的预后因子。第二部分 CKS2在胶质母细胞瘤细胞系中的表达及干扰CKS2基因对细胞增殖、侵袭和凋亡的影响研究目的：1、探究人胶质母细胞瘤细胞系(U87、U251和A172)中CKS2的表达情况。2、探究干扰CKS2基因对人胶质母细胞瘤细胞系U87/U251增殖、侵袭和凋亡的影响。研究方法：1、人胶质母细胞瘤细胞系的培养：人胶质母细胞瘤细胞系U87、U251、A172均购于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库,于液氮冻存。采用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基,5%CO2、37℃条件下培养,稳定传代3次后用于后续实验工作。2、CKS2-shRNA的构建：设计合成CKS2 shRNA寡核苷酸序列,退火连入BglⅡ和HindⅢ双酶切的psuper质粒,测序验证序列。3、CKS2基因干扰效率的检测：设置空白对照组、shCON组和CKS2 shRNA转染组,将psuper-shCKS2电转入U87细胞系,电转染后48h收集细胞,提取总RNA,反转录为cDNA,应用real-time PCR法检测CKS2基因的mRNA表达水平：同时提取总蛋白,Western blot法检测CKS2蛋白的表达水平。4、干扰CKS2基因对GBM细胞系U87/U251细胞增殖的影响：设置空白对照组、shCON组和CKS2 shRNA转染组,电转U87/U251细胞,24小时后将细胞用胰酶消化后计数,按1000个、孔的密度接种于96孔细胞培养板中,于第0、12、24、48、72和96h采用CCK-8比色法检测各组细胞增殖情况。5、检测干扰CKS2基因对GBM细胞系U87/U251侵袭能力的影响：设置空白对照组、shCO N组和CKS2 shRNA转染组,电转U87/U251细胞,完全培养基培养24h换无血清培养基继续培养24h,将细胞用胰酶消化后计数,用含01%BSA的无血清培养基调整细胞密度至2000个/孔。于24孔板中加入600μL完全培养基；Transwell小室内部加入200μL细胞悬液。将24孔板轻轻放进细胞培养箱中培养48h；轻轻吸去上室培养基,擦去上室内的细胞；将小室底面浸入4%多聚甲醛中固定细胞10分钟,转移至纯净水中,把多聚甲醛洗掉,再把小室底面浸入结晶紫染液中染色20min,用纯净水清洗。镜下随机选取5个视野,计数穿过膜细胞数。6、检测CKS2基因沉默对GBM细胞系U87/U251凋亡的影响：设置空白对照组、shCON组和CKS2 shRNA转染组,电转U87/U251细胞,培养细胞趴片,24小时后无血清培养基进行饥饿培养48h。风干细胞,4%多聚甲醛室温固定1小时。PBS洗2次,每次5分钟。用透化溶液(0.1% TritonX-100;0.1%柠檬酸)冰上透化细胞2分钟,加入标记反应液,避光37℃孵育1h,防荧光淬灭剂封片后,随机选取5个视野,镜下拍照并计数。7、数据分析：各实验均重复3次,采用统计学软件SPSS21.0分析,应用t检验分析细胞实验CKS2-shRNA组与空白对照组和shCON组数据的差异；P<0.05为差异有统计学意义。实验结果：1、CKS2-shRNA能够有效下调CKS2 mRNA和蛋白在U87细胞系中的表达。RT-PCR显示,转染48小时后与对照组相比CKS2-shRNA可以有效降低 CKS2在mRNA水平的表达(P<0.05)；WB结果显示,与对照组相比,CKS2-shRNA降低CKS2蛋白水平的表达(P<0.05)。2、CKS2基因干扰对GBM细胞系增殖能力的影响：U87细胞：CCK-8增殖活性检测实验示,与空白对照组相比,从12h开始,CKS2-shRNA组增殖活性开始出现明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与shCON组相比,从12h开始,CKS2-shRNA组增殖活性开始出现明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。U251细胞：CCK-8增殖活性检测实验示与空白对照组,从24h开始,CKS2-shRNA组增殖活性开始出现明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与shCON组相比,从24h开始,CKS2-shRNA组增殖活性开始出现明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、CKS2基因沉默对GBM细胞系U87/U251侵袭能力的影响：Transwell侵袭试验结果显示,与空白对照组相比,穿过transwell小室底部的细胞(结晶紫染色细胞)明显减少,差异具有统计学意义(PU87<0.05,Pu251<0.05),提示CKS2-shRNA组侵袭能力明显下降；与shCON组相比,穿过transwell、室底部的细胞(结晶紫染色细胞)也明显减少,差异具有统计学意义(PU87<0.05,PU251<0.05), CKS2-shRNA组侵袭能力也明显下降；而空白对照组与shCON组相比,侵袭能力无明显差异(PU87>0.05, PU251>0.05)。4、CKS2基因沉默对GBM细胞系U87/U251凋亡的影响：与空白对照组相比,CKS2-shRNA组凋亡率升高,差异具有统计学意义(PU87<0.05, PU251<0.05);与shCON组相比,CKS2-shRNA组凋亡率升高,差异具有统计学意义(PU87<0.05, PU251<0.05);空白对照组与shCON组相比,凋亡率无明显差异(PU87>0.05, PU251>0.05)。结论：1、CKS2在人胶质母细胞瘤细胞株U251、U87和A172中均有表达。2、在U87/U251细胞中干扰CKS2的表达后,与空白对照组和shCON组相比,肿瘤细胞增殖能力和侵袭能力下降,凋亡增加。第三部分CKS2对胶质母细胞瘤细胞系信号通路的影响研究目的：1、探究CKS2对胶质母细胞瘤中PI3K/AKT/mTOR通路关键蛋白AKT和mTOR磷酸化水平的影响。2、探究CKS2对胶质母细胞瘤中MAPK通路关键蛋白ERK1/2磷酸化水平的影响。研究方法：1、用电转染方法将CKS2 shRNA质粒转入胶质母细胞瘤细胞系U87/U251中,分别选取选取空白对照组、shCON组、CKS2 shRNA转染组转染生长状态良好,处于对数生长期的细胞,提取细胞总蛋白,用vestern blot的方法检测PI3K/AKT/mTOR通路关键蛋白AKT和mTOR磷酸化水平(磷酸化蛋白/总蛋白)的改变。2、分组、转染和蛋白提取同1,用western blot的方法检测MAPK通路关键蛋白ERK1/2磷酸化水平的改变。研究结果：1、与空白对照组相比,CKS2-shRNA组的AKT磷酸化程度明显下降,两组之间p-AKT/AKT表达比值的差异具有统计学意义(PU87<0.05, Pu251<0.05);与shCON组相比,CKS2-shRNA组的AKT磷酸化程度明显下降,两组之间p-AKT/AKT表达比值的差异具有统计学意义(PU87<0.05, PU251<0.05);空白对照组与shCON组之间AKT磷酸化程度无统计学差异(PU87>0.05, PU251>0.05)。2、与空白对照组相比,CKS2-shRNA组的mTOR磷酸化程度明显下降,两组之间p-mTOR/mTOR表达比值的差异具有统计学意义(PU87<0.05,PU251<0.05);与shCON组相比,CKS2-shRNA组的mTOR磷酸化程度明显下降,两组之间mTOR磷酸化的差异具有统计学意义(PU87<0.05, PU251<0.05);空白对照组与shCON组之间mTOR磷酸化程度无统计学差异(PU87>0.05, PU251>0.05)。3、与空白对照组相比,CKS2-shRNA组的ERK磷酸化程度明显下降,两组之间p-ERK/ERK表达比值的差异具有统计学意义(PU87<0.05, PU251<0.05);与shCON组相比,CKS2-shRNA组的ERK磷酸化程度明显下降,两组之间ERK磷酸化的差异具有统计学意义(PU87<0.05, PU251<0.05);空白对照组与shCON组之间ERK磷酸化程度无统计学差异(PU87>0.05,PU251>0.05)结论：1、CKS2可能通过影响PI3K-AKT-mTOR信号通路影响胶质母细胞瘤的发生与发展。2、CKS2可能通过影响ERK信号通路影响胶质母细胞瘤的发生与发展。