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本试验以定位研究为切入点,制备了抗MxlRTl蛋白非保守区的多克隆抗体,并以基因枪轰击洋葱表皮细胞,结果表明MxlRTl蛋白定位在质膜上:以对缺铁敏感的苹果基因型山定子叶片为外植体,系统研究叶片分化不定芽的诸多因素,建立稳定、高效的叶片再生体系,在此基础上进行山定子的遗传转化,以期培育抗缺铁的山定子新种质。具体结果如下:
1.利用MxlRTl基因非保守区构建原核表达载体pGEX-MxlRTlK,诱导表达经SDS-PAGE电泳结果表明,可正确表达出约32KD左右的GST-MxlRTlK融和蛋白。通过亲和层析,纯化融和蛋白并制备抗体,酶联免疫(ELISA)分析和Western blotting表明所制备抗体有效。
2.构建瞬时表达载体pMxlRTrl-GFP,通过基因枪轰击洋葱表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜(ConfocaL)观察,结果表明,MxlRTl蛋白主要定位在细胞膜上。
3.适宜山定子叶片再生的基本培养基为MS+4mg/L BA+0.5mg/L NAA;暗培养10天效果较好;以山梨醇为碳源、Gelrite为固化剂再生效果较好;山定子近轴面或远轴面接触培养基二者无显著差别;再生率达到97%,单叶片再生芽数达到8.7个/叶。
4.利用根癌农杆菌菌株EHAl05,通过叶盘法将MxlRTI基因转入山定子中,PCR结果表明有5个株系带有目的基因。