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研究背景人牙周膜干细胞(human periodontal stem cells,hPDLSCs)来源于牙周膜,属于间充质来源的成体干细胞,其具有分化为组织中特定的功能相关性细胞的多向分化能力和在生命体内能够增殖并形成组织从而维持自身的数量,在体外可以克隆性生长的自我更新能力。当牙周损伤导致牙槽骨缺损后,具有成骨潜能的hPDLSCs迁移至缺损区并分化为成骨细胞,从而修复牙槽骨的缺损。hPDLSCs的成骨潜能在牙周组织的自我更新以及牙周病变组织的修复与再生过程中发挥了重要作用,但目前仍未能够具体阐明hPDLSCs的成骨分化机制,有待进一步的探索。MicroRNA(miRNA,微小RNA)是一类内源性非编码蛋白质的微小RNA,广泛存在于自然界多种真核生物体内,可通过降解靶基因、抑制靶基因翻译或两种方式结合的作用方式发挥抑制mRNA表达的功能。目前已有研究表明,miRNA对干细胞的未分化性及自我更新能力的维持有重要意义。同时,已有研究发现,miRNA具有调控hPDLSCs成骨分化的功能。在成骨分化过程中,特定基因严格按照特定的顺序激活与关闭,控制着成骨分化的不同阶段。而成骨分化的早期将决定未来细胞的发展方向。因此,研究miRNA对hPDLSCs成骨分化早期的调控机制,将为牙周缺损修复以及组织再生、牙周病导致牙槽骨缺损的临床治疗及预后提供新的作用靶点。基于此,本研究通过构建miR-218-5p抑制表达及过表达慢病毒,研究miR-218-5p在人牙周膜干细胞成骨分化早期发挥的功能,预测并验证miR-218-5p通过靶向调控COL1A1(collagen,type Ⅰ,alpha 1,Ⅰ型胶原α1)发挥抑制成骨作用的分子机制。研究结果为在人牙周膜干细胞成骨分化早期中miRNA发挥功能的调控机制提供了有力证据,为干细胞治疗提供了新的思路。材料与方法1.miR-218-5p在hPDLSC成骨分化中的表达本实验采用恒前磨牙或第三磨牙,采用改良酶组织块法分离培养细胞,利用有限稀释法对培养出的细胞进行分离纯化。CCK8方法检测细胞增殖能力,计算数据并绘制细胞生长曲线。取第3代人PDLSCs于流式细胞仪检测表面分子标记物,倍比稀释法将人PDLSCs接种于培养皿中,观察细胞单克隆形成情况,并计算细胞克隆形成率。对培养的人PDLSCs进行成骨诱导7d后用碱性磷酸酶染色;成骨、成脂诱导14d后,分别用茜素红S及油红O染色剂染色,倒置显微镜下观察分化能力。对培养的hPDLSCs进行成骨诱导并提取总RNA,利用qRT-PCR检测成骨诱导第7d时miR-218-5p的表达变化情况。2.miR-218-5p在hPDLSCs成骨分化早期的功能学研究构建miR-218-5p过表达及抑制表达慢病毒,通过设置不同感染复数转染hPDLSCs并筛选出最佳感染复数。按实验设计分别以最佳感染复数转染hPDLSCs,通过qRT-PCR检验miR-218-5p慢病毒在hPDLSCs中稳定过表达或抑制表达。分组提取培养3、7、14、21d后的hPDLSCs总RNA及蛋白,qRT-PCR、Western Blot技术检测成骨相关基因的表达变化,同时对培养7天后的各组细胞进行ALP染色观察。3.miR-218-5p通过靶向作用COL1A1抑制hPDLSC早期成骨分化利用9个数据库预测miR-218-5p的靶基因,取预测结果交集靶位点的mRNA进行分析,并筛选出COL1A1,对其进行基因和蛋白水平变化的验证。构建miR-218-5p、COL1A1突变型及野生型载体质粒,通过双荧光素酶报告检测二者间的结合位点。4.统计学分析本研究所得数据均采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析,以x ± s表示,用两独立样本t检验进行两组间比较,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.miR-218-5p在hPDLSC成骨分化中的表达本实验成功分离培养hPDLSCs。通过流式细胞术检测发现,分离培养的hPDLSCs阴性造血干细胞表面标记物,阳性表达间充质干细胞表面标记物,提示细胞为间充质来源。并对培养的hPDLSCs进行成脂诱导及成骨诱导,可见细胞内有大量橘红色脂滴形成,细胞间大量矿化结节。2.miR-218-5p在hPDLSCs成骨分化早期的功能学研究与对照组细胞相比,转染miR-218-5p过表达慢病毒的细胞中几乎看不到矿化结节形成,成骨相关mRNA及蛋白的表达均显著下降;而转染miR-218-5p抑制表达慢病毒的细胞成骨能力明显提高,成骨相关mRNA及蛋白水平的均明显上升。3.miR-218-5p通过靶向作用COL1A1抑制hPDLSC早期成骨分化取9个数据库预测靶基因结果的交集,通过查阅文献,最终选取COL1A1作为miR-218-5p的靶基因进行荧光素酶报告验证,结果发现miR-218-5p可与COL1A1在3 ’ UTR上的预测靶位点相结合,提示miR-218-5p可能通过调节靶基因COL 1A1,参与PDLSCs成骨分化的过程。qRT-PCR检测发现,空白对照组细胞的COL1A1表达量在7天达到峰值,随后在14天及21天下降,而miR-218-5p的表达量在成骨诱导后7天最低,在14天及21天有一定的上升,成骨相关mRNA及蛋白的表达均显著下降;而转染miR-218-5p抑制表达慢病毒的细胞成骨能力明显提高,成骨相关mRNA及蛋白水平的表达均明显上升。结论(1)本实验成功分离并在体外培养人牙周膜干细胞,并证实其具有成体干细胞的多向分化能力。(2)证实miR-218-5p在hPDLSCs的成骨分化中起抑制人牙周膜干细胞成骨分化的功能。(3)通过生物信息学预测并验证COL1A1为miR-218-5p的靶基因,证实miR-218-5p可在hPDLSCs成骨分化早期通过与COL1A1靶向结合,抑制COL1A1的表达,发挥抑制成骨的功能,并预测miR-218-5p与COL1A1在3’UTR端存在连续结合位点。