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疼痛是癌症患者最为常见的症状之一,据统计,大约30-50％的癌症患者会有中到重度疼痛,尤其是晚期癌症的患者,约75-95％会发生难以控制的慢性疼痛。不少癌症患者就诊时的首要症状就是疼痛。由于癌症痛的机制尚不明了,仍约有45％的癌症痛得不到有效控制,因此研究癌症痛机制,寻找缓解癌症痛的新方法,提高肿瘤患者生存质量,成为当前急需解决的问题。临床最常见的三大肿瘤为肺癌、乳腺癌、前列腺癌,此类肿瘤晚期很容易发生骨转移,而骨癌痛则是慢性癌痛最为常见的一种,因此从研究骨癌痛的发生发展机制入手揭开癌症痛的机制有重要的临床意义。
2002年Medhurst等首先建立了大鼠骨癌痛模型,为探索骨癌痛的发生机制,寻找有效的治疗方法提供了良好的机遇。但其所用的MRMT-1乳腺癌细胞国内较难获得,因而不少学者仍在探索新的肿瘤细胞株来建立大鼠骨癌痛模型。本课题组前期研究采用Walker256细胞探索建立大鼠的骨癌痛模型取得了成功。在模型动物中,荷瘤侧肢体表现出负重减少、异常性疼痛或痛觉过敏等相关行为学改变,其程度与骨质破坏程度密切相关,与临床癌症痛表现出相似特征。而相应的脊髓节段也发生一些特征性的神经化学改变,提示骨癌痛是一种特殊类型的疼痛,神经传递通路上存在有痛觉敏化机制。
近年来在疼痛机制的研究中P2X受体的作用逐渐受到重视,P2X嘌呤受体为ATP的受体,是配体门控阳离子通道,有7个亚单位,其中P2X3亚单位高度选择性表达于小直径的感觉神经元,与痛觉信号传递密切相关。那么ATP及其P2X3受体是否参与了骨癌痛的痛觉敏化机制昵?某些研究提示了一些线索,Maehara等发现在肿瘤组织中ATP含量明显高于正常组织,而Gilchrist等在小鼠骨癌痛模型中进行免疫荧光检测发现其周围神经末梢纤维P2X3受体表达显著增多,而且从神经纤维的分类上看主要表现为与肽能神经纤维共表达增加。这些发现似乎暗示着P2X3可能参与了骨癌痛痛觉敏化的外周敏化机制。由于脊髓背根神经节(DRG)是初级感觉传入神经元胞体所在地,因而本研究计划从DRG入手研究骨癌痛痛觉敏化机制。
本课题分四个步骤：(1)通过大鼠胫骨内注射walker256乳腺癌细胞建立骨癌痛模型并观察其行为学变化的特点；(2)观察DRG神经元中P2X3受体mRNA和蛋白表达情况；(3)利用全细胞膜片钳技术分析DRG神经元P2X3受体功能的变化；(4)利用在体实验运用P2X3受体的阻断剂suramin鞘内注射是否能够缓解骨癌痛。通过以上实验探讨P2X3受体是否和如何参与了骨癌痛的痛觉敏化过程。
结果：
1.模型建立情况
雌性Wistar大鼠胫骨内接种2×105个Walker256细胞,接种肿瘤后(PID)21d统计致瘤率70％,大鼠PID10天开始出现自发痛(SPAS)评分增高,在PID14～21天出现明显的跛行或后肢不负重,部分大鼠对患侧足有自噬现象,同时伴有进食减少,体重下降；诱发痛实验主要表现为机械性痛觉过敏而无明显的热痛觉过敏,与文献报道一致。影像学观察PID 8天时尚无明显改变,至PID21d时可见骨质明显增生,病理检查可见晚期胫骨外观呈膨胀性增生,胫骨内有肿瘤生长,同时有破骨和成骨样改变。脊髓切片GFAP染色见患侧星形胶质细胞明显增生。以上结果表明大鼠骨癌痛模型成功建立,模型主要行为学特征为机械性痛觉过敏和自发性运动疼痛。
2.P2X3受体在DRG神经元中的表达
免疫荧光标记见骨癌痛模型组患侧L4～L5节段DRG神经元P2X3在PID14天、21天时表达明显增高,主要表达在中、小直径神经元。对照组、假手术组、骨癌痛组14天、21天P2X3受体阳性神经元百分比率分别为30.71％、32.3％、48.78％和46.27％。western blot实验与免疫组化结果一致,对照组、假手术组、骨癌痛组14天、21天P2X3受体表达相对量(P2X3/β-actin)分别为0.58±0.16,0.56±0.17,1.26±0.25,1.30±0.43。realtime RT-PCR骨癌痛模型组P2X3 mRNA在PID 14天、21天时明显增高但两者之间无显著差异。以上结果提示骨癌痛大鼠在PID 14至21天疼痛行为学改变明显时DRG神经元中P2X3受体表达也是增加的,且这种增加可能与P2X3 mRNA表达增加有关。
3.P2X3受体电生理功能的变化
骨癌痛组DRG神经元的形态及被动膜电生理特性包括膜电容、静息电位等与对照组相比均无显著差异,但由αβ-me-ATP 100μM引发的内向电流明显增强,有反应细胞的比率增高,这种内向电流可以被suramin 30μM阻断。以反应时程为基础,内向电流可以区分为快反应、慢反应和混合反应型电流,骨癌痛组DRG神经元中三种反应类型电流所占百分比率没有显著差异。
4.在体应用P2X3受体阻断剂的结果
PID14～16d鞘内连续给予suramin 50μg/天可明显缓解骨癌痛大鼠的机械性痛觉过敏,痛阈明显提高,接近正常对照水平,而suramin对正常大鼠痛阈无显著影响。
结论:
根据以上结果可以得出如下结论：
1.胫骨内接种Walker256乳腺癌肉瘤细胞可以成功构建大鼠胫骨骨癌痛模型,其行为学特征主要表现为自发性疼痛和机械性痛觉过敏。
2.P2X3参与了骨癌痛大鼠的痛觉敏化机制
(1)骨癌痛大鼠痛觉行为学改变与其脊髓背根神经节中P2X3表达显著增高有关,而后者可能与P2X3 mRNA表达增加有密切关系。
(2)骨癌痛大鼠DRG中P2X3电生理功能增强,主要表现为P2X3激动剂αβ-me-ATP引发的内向电流增强及有反应细胞的比率增高。
(3)鞘内运用P2X3受体阻断剂suramin可明显缓解骨癌痛。