研究背景：　　 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)属于革兰阴性需氧菌，是人体最常见的条件致病菌之一，当机体免疫力低下或者机体的完整物理屏障受到破坏的时候，铜绿假单胞菌可引起非常高的发病率，其在医院获得性感染中占有非常重要的地位。近年来，由于铜绿假单胞菌分离率高及时常的爆发流行，并且对多种抗菌药均产生耐药，治疗极其困难，越来越受到广大医护人员的重视。　　 以亚胺培南(Imipenem，IPM)为代表的碳氢霉烯类抗菌药是最近研制开发的广谱β-内酰胺类抗生素，对铜绿假单胞菌有较强的杀菌力，是近年来治疗严重铜绿假单胞菌感染的最主要药物。然而，随着碳青霉烯类抗生素的大量临床应用，亚胺培南耐药铜绿假单胞菌在世界范围内均有报道，并且耐药率有逐年上升的趋势。目前认为铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药耐药机制主要有：1.β-内酰胺酶的水解作用，主要是金属β-内酰胺酶(MBLs)；2.特异性外膜孔蛋白OprD基因突变、表达量降低或完全缺失均可致外膜通透性降低，使得碳青霉烯类抗生素，尤其是亚胺培南难以进入菌体内发挥作用；3.作用靶位(青霉素结合蛋白)的改变导致抗菌药物与之亲和力降低；另外，还有主动外排系统的高表达和生物膜的产生等可能的耐药机制存在。　　 本实验室前期部分研究成果提示：铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一——金属β-内酰胺酶的产生在广州地区亚胺培南耐药的铜绿假单胞中所占的比例为13.4％，其它大多数耐药菌株中并未发现金属β-内酰胺酶的产生，而且金属酶产生与菌株对亚胺培南的耐药程度不平行，说明该类菌株存在除此机制之外的其它耐药机制。　　 目的：　　 1.了解铜绿假单胞菌对常见抗生素的耐药情况及其耐药谱特征，以指导临床合理选用抗生素；　　 2.明确外膜孔蛋白OprD的基因突变、表达减少或缺失是否是广州地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一；　　 3.明确青霉素结合蛋白的改变是否在广州地区铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药中发挥作用。　　 方法：　　 1.依据美国临床和实验室标准化协会(CLSI，原名NCCLS)2009年版推荐的纸片扩散法进行药敏试验；　　 2.采用实时荧光定量PCR法对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌及对照株进行OprD基因相对定量及分析；　　 3.设计合成针对OprD编码区基因全长的引物序列，对OprD表达升高的菌株进行PCR扩增，并对PCR产物进行DNA测序、后续比对和三维结构预测分析；　　 4.设计合成pbp1b、pbp2、pbp3和pbp6的包括丝氨酸活性中心部位SXXK盒在内的引物序列，采用PCR技术进行基因扩增，并对PCR产物进行DNA测序分析。　　 结果：　　 1.细菌药敏试验结果显示，168株铜绿假单胞菌对下列抗生素的平均耐药率分别为：亚胺培南(29.17％)、美罗培南(19.64％)、头孢他啶(10.71％)、头孢吡肟(14.28％)、庆大霉素(42.86％)、阿米卡星(32.74％)、环丙沙星(10.12％)、左旋氧氟沙星(17.26％)、氨曲南(14.88％)；其中亚胺培南耐药的有49株，而且大多数为多重耐药菌株；　　 2.49株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中15株未检测到OprD基因的表达，27株OprD相对表达量较对照株降低，表达减少或缺失的占85.71％，7株铜绿的OprD相对表达量较对照株升高。本地区7株之间OprD基因同源性高，其中6菌株的OprD基因与北非和意大利分离株的OprD基因同源性较低。三维结构预测表明，其中2株有较明显的外膜孔蛋白通道的变窄；　　 3.青霉素结合蛋白编码基因PCR产物测序结果与铜绿假单胞菌标准对照株PAO1相比未发现保守区SXXK盒及其周围的氨基酸改变。　　 结论：　　 1.2005年-2007年广州地区铜绿假单胞菌整体耐药现象严重，对亚胺培南的耐药率较高，而且大多数为多重耐药菌；　　 2.外膜孔蛋白OprD的改变是广州地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制之一；　　 3.广州地区亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中的青霉素结合蛋白基因相对稳定，与其对亚胺培南的耐药性变化关系不大；　　 4.广州地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制具有多样性，部分菌株至少同时存在金属酶的产生和外膜孔蛋白OprD的改变这两种耐药机制。