坦布苏病毒感染(Tembusu virus infection),是我国在2010年新出现的由坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)引起的一种传染性疾病,该病主要引起产蛋鸭产蛋下降以及雏鸭出现头颈震颤、四肢麻痹等神经症状。目前该病在我国养鸭集中的地区均有发生,给养鸭业造成了巨大的损失(Su,et al.2011)。TMUV属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)、恩塔亚病毒群(Ntaya virus group)(Cao,et al.2011)。本试验就TMUV能否在种鸭中垂直传播及TMUV对种鸭的致病性进行研究,为该病的控制提供可靠的流行病学依据。1、自然感染病例种鸭、种蛋、鸭胚、雏鸭中TMUV检测2013年,山东省聊城、泰安、广饶地区共4个种鸭场相继发生TMUV自然感染。收集发病鸭产的种蛋,共125枚。从中随机抽取35枚种蛋,无菌收取卵黄膜样品。将其余90枚种蛋(自然感染组)全部孵化,按照孵化场中樱桃谷种鸭蛋孵化要求设置孵化参数。同时,取20枚健康樱桃谷种鸭蛋作为对照组进行孵化。将不同来源的种蛋分开孵化。每天照蛋一次,挑出未受精蛋和死亡鸭胚,及时无菌收取卵黄膜或胚脑、肝、脾等样品。对出壳雏鸭在1日龄剖杀,取脑、肝、脾等组织。所有收取的样品置于-80oC保存。通过尿囊腔途径接种9日龄健康鸭胚进行病毒分离,采用半套式RT-PCR检测方法对收获的尿囊液进行病毒检测。结果显示,自然感染组总受精率为82.22%(74/90),总孵化率为62.16%(46/74);对照组的受精率和孵化率分别为95%(19/20)和84.21%(16/19)。在孵化过程中,28枚(31.1%)鸭胚死亡,剖检可见胚脑充血、出血、水肿,心脏和肝脏出血。病毒检测结果显示,种蛋、死亡鸭胚和雏鸭中TMUV检出率分别为51.43%(18/35)、60.71%(17/28)和10.87%(5/46)。此外,挑出的16枚未受精种蛋中有2枚检测为TMUV阳性(12.5%)。总计,自然感染组的TMUV总检出率为33.6%(42/125)。对照组的种蛋、鸭胚和雏鸭检测均为TMUV阴性。首次从死亡鸭胚中分离到一株TMUV,命名为TMUV-SDDE株,该分离株的ELD50为10-2.50/0.2 mL。用PCR扩增TMUV-SDDE的E基因,测序。序列分析结果显示,TMUV-SDDE与其他TMUV分离株的同源性高达96%-99.5%。经动物回归试验,可以从攻毒雏鸭中重新分离到该病毒。根据本试验结果,我们推测TMUV可能经种蛋发生垂直传播。2、tmuv人工感染动物模型的建立基于上述试验结果,我们通过人工感染tmuv阴性的健康樱桃谷种鸭建立动物模型,进行tmuv能否垂直传播及tmuv对种鸭致病性的研究。将38周龄的樱桃谷种鸭随机分为a、b、c、d、e五组。a、b、c三组,每组15只母鸭、4只公鸭,公母鸭混群饲养。a组母鸭和b组公鸭静脉接种tmuv-sdsg株(eld50=10-2.37/0.2ml),2.5ml/只,a组公鸭和b组母鸭不接种病毒。c组作为对照组,接种等量生理盐水。d和e组各20只母鸭,d组静脉接种2.5ml的tmuv-sdsg株,e组接种等量生理盐水。各组隔离饲养。收集a、b、c三组种蛋,分别孵化,记录种蛋受精和孵化情况。出壳后的1日龄雏鸭,随机剖杀其中的一部分,取脑、肝、脾等。其余的雏鸭饲养于spf隔离罩中,至15日龄剖杀,取脑、肝、脾等。收取饲养过程中死亡雏鸭的上述组织。对收集的各组织进行处理后,接种鸭胚进行病毒分离和半套式rt-pcr检测。结果显示,a组种蛋的受精率和孵化率分别82.2%(74/90)和62.2%(46/74),b组种蛋的受精率和孵化率分别为78.0%(67/86)和65.7%(44/67),而c组种蛋的受精率和孵化率分别为94%(94/100)和85.1%(80/94)。a组43枚和b组37枚鸭胚在孵化过程中死亡。剖检可见,胚体出血、卵黄吸收不良、卵黄稀薄、肝脏或心脏出血。有的鸭胚颈部水肿、出血,脑水肿、充血。a组4只和b组7只弱雏死亡,剖检可见脑水肿、或有出血点,卵黄吸收不良。病毒检测结果显示,a组种蛋、死亡鸭胚、1日龄雏鸭、15日龄雏鸭和死亡弱雏中tmuv检出率分别为60%,67.44%,35.48%,16.67%和100%。b组相应的tmuv检出率分别为50%,51.35%,46.88%,10%和71.43%。c组各样品未检测到tmuv。将阳性扩增片段进行序列分析,结果与tmuv-sdsg株同源性在98.7%-100%。从种蛋、鸭胚到孵出的雏鸭均能检测到tmuv,表明tmuv可以通过感染的种鸭经鸭胚传给下一代,即tmuv可以在种鸭中发生垂直传播。3、tmuv对种鸭的致病性研究d和e组,每组随机标记出10只,分别在1、4、7、10、13、16、19dpi采血一次,采集泄殖腔棉拭子样品一次,用间接elisa方法检测鸭血清中抗体水平,用细胞因子检测试剂盒检测ifn-γ和il-4水平,用半套式rt-pcr检测攻毒鸭排毒情况。每组另外10只,分别在3、7、11、15、19dpi随机剖杀两只,无菌采集脑、肝脏、脾脏、卵泡膜等组织,制作病理切片,用荧光定量pcr检测各组织中tmuv载量。结果显示,攻毒后,攻毒组种鸭产蛋下降(约由80%至60%),排白色稀便。攻毒组种鸭抗体水平从1dpi后开始升高;至10dpi左右,达到最高水平;之后逐渐下降。IL-4和IFN-γ表达水平均在1dpi后开始上升,分别在13dpi和16dpi达到高峰,之后开始下降。对照组种鸭的抗体阴性,IFN-γ和IL-4表达水平无明显变化。从4dpi开始能够检测到排毒,一直持续到试验结束时(19dpi)检测仍为阳性。在3dpi时,仅脑、胰脏、卵泡膜检测为TMUV阳性;在7dpi时,卵泡膜、脑、胰脏、脾脏、肝脏、十二指肠检测为TMUV阳性;从11dpi开始,各组织均检测为TMUV阳性,其中卵泡膜、脑、胰脏、肝脏病毒载量较高。上述结果表明,TMUV感染种鸭后能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;病毒主要侵害种鸭的卵泡、脑、胰脏、肝脏等组织器官;攻毒后种鸭可经泄殖腔排毒,且持续时间较久,有利于TMUV在鸭群中的传播。