卒中具有高致残率、高复发率和高病死率三大特征,极大地危害着人类的健康。这类疾病通常会引起感觉运动功能损伤和认知障碍,使患者散失工作和自理能力。目前,临床上主要使用组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activtor,tPA）对卒中患者进行溶栓治疗。但是,对于tPA的使用有严格的时间窗,也存在出血风险。由于临床上也并没有其他能够有效治疗脑缺血的药物,所以开发安全且有效的脑缺血治疗药物就显得格外重要。突触后致密蛋白-95（postsynaptic density protein-95,PSD-95）作为一个支架蛋白,它能够连接N-甲基-D-门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptors,NMDARs）和神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）,从而形成三元复合物。局部大脑缺血过度激活NMDARs,引起nNOS与PSD-95相互作用增强,导致一氧化氮（nitric oxide,NO）生成异常增加,最终引起神经元的损伤。在脑缺血急性期干预nNOS和PSD-95的耦联能够显著降低缺血损伤。我们前期研发的nNOS–PSD-95解耦联小分子化合物ZL006,它在急性期具有很强的神经保护活性但没有明显的副作用。卒中的治疗有一个黄金时间,也就是发病后3-4小时内。而大部分没有医学知识背景的患者对卒中的认识不够,或其他一些因素的影响导致患者错过最佳治疗时间。所以,探究在延迟期具有治疗效应的药物也将成为非常重要的一个研究方向。尽管前期的研究表明ZL006是治疗卒中非常有潜力的一个新药,目前ZL006的治疗只局限在急性期,那么它在延迟期是否也能够对抗缺血治疗呢?ZL006抑制nNOS-PSD-95耦联主要通过提高:神经保护、神经发生、神经可塑性三个方面来促进功能恢复。对于神经可塑性的调控,γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）能系统是必不可少的,因为它可以控制神经元的兴奋性。有研究表明,在脑缺血延迟期由GABA介导的紧张型抑制（tonic inhibition）作用增强,降低缺血大脑皮层的GABA能抑制能促进功能恢复。而脑缺血后NMDAR-PSD-95-nNOS这条通路激活后会引起NO的释放增加,NO作为一个神经调质,可以影响多种递质的释放,其中就包括抑制性递质GABA。所以,延迟干预nNOS-PSD-9很有可能具有治疗效应。因此,本文进行了以下三个方面的研究,第一:探究延迟干预nNOS-PSD-95耦联是否会影响紧张型抑制和脑缺血后运动神经功能;第二:探讨延迟干预nNOS-PSD-95耦联对神经可塑性的影响;第三:阐述延迟干预nNOS-PSD-95耦联调控脑缺血后功能修复的分子机制。第一章延迟干预nNOS-PSD-95耦联降低紧张型抑制并促进脑缺血后功能恢复为了探究延迟干预nNOS-PSD-95耦联对脑缺血的影响,本文使用膜渗透性重组多肽Tat-nNOS-N_1-133和小分子化合物ZL006抑制nNOS-PSD-95耦联。我们采用光化学诱导血栓形成性脑缺血模型（Photothrombotic ischaemia）,首先检测了脑缺血后nNOS-PSD-95的耦联时程。结果显示,脑缺血后损伤周围区nNOS-PSD-95耦联增加并持续至第7 d。根据这个结果,在脑缺血后4-10 d我们通过微量给药系统连续给予Tat-nNOS-N_1-133至小鼠大脑皮层的损伤周围区,然后采用全细胞电压钳记录脑缺血后7-11 d损伤周围区神经元的紧张型抑制性电流(Tonic inhibition currents,I_tonic)。结果表明,脑缺血后由GABA介导的I _tonic异常升高。非常有趣的是我们发现Tat-nNOS-N_1-133通过干扰nNOS-PSD-95耦联能够抑制紧张型抑制性电流的增加。但是,Tat-nNOS-N_1-133治疗没有影响自发的抑制性突触后电流（spontaneous inhibitory postsynaptic currents,sIPSC）,而且在灌流液中加入ZL006也没有影响正常海马组织诱发的抑制性突触后电流（evoked inhibitory postsynaptic currents,eIPSC）。所以,nNOS-PSD-95解耦联抑制GABA介导的紧张型抑制而不是时相型抑制（phasic inhibition）。根据文献报道降低紧张型抑制的水平可以改善脑缺血后运动功能,因此我们猜想延迟干预nNOS-PSD-95耦联很有可能能够促进脑缺血后运动功能恢复。为了验证这一猜想,我们在脑缺血后4-10 d向脑区立体定位注射Tat-nNOS-N_1-133或者腹腔注射ZL006,在11 d进行网格和圆筒实验,检测小鼠运动功能的改变。结果显示,Tat-nNOS-N_1-133和ZL006都能够明显逆转由脑缺血引起的网格实验中小鼠失足率和圆筒实验中的不对称指数的增加,改善了小鼠的运动功能。而且,ZL006对脑缺血的的治疗作用在nNOS敲除鼠上被取消,这就提示ZL006的作用是依赖于nNOS的。最后,我们构建了重组腺相关病毒AAV-nNOS-N_1-133-GFP,它能够选择性表达nNOS与PSD-95相互作用的关键区域nNOS-N_1-133,长时间的阻断nNOS-PSD-95耦联。我们在脑缺血造模后即刻向损伤周围区注射AAV-nNOS-N_1-133-GFP,在造模后11、18、32和46 d进行行为学检测。与对照病毒AVV-GFP感染的小鼠相比,AAV-nNOS-N_1-133-GFP感染小鼠的失足率和不对称指数均得到持续改善。综合以上结果可知,光化学诱导脑缺血后大脑皮层损伤周围区紧张型抑制增加,而延迟干预nNOS-PSD-95耦联能降低紧张型抑制,但对时相型抑制没有影响;延迟干预nNOS-PSD-95耦联促进脑缺血后运动功能恢复。第二章延迟干预nNOS-PSD-95耦联对神经可塑性的影响本章研究了延迟干预nNOS-PSD-95耦联降低紧张型抑制后,对神经可塑性的影响。首先,我们在体外采用氧糖剥夺（Oxygen and glucose deprivation,OGD）实验来模拟脑缺血模型。我们将神经元和星形胶质细胞共培养,9-10 d进行OGD造模。OGD造模后神经元树突棘密度、树突长度以及树突分支数都有明显的下降;而OGD 24 h后孵育Tat-nNOS-N_1-133或GABAA类受体α5亚型（α5-GABA_A receptors,α5-GABA_ARs）的反向激动剂L655,708 24 h均能够显著提高树突棘密度,但对树突长度和树突分支数没有影响。L655,708和Tat-nNOS-N_1-133也能够明显逆转由OGD引起的突触相关蛋白Synapsin和PSD-95表达水平的下调。因此,阻断过多的紧张型抑制能提高树突棘密度和促进突触发生。为进一步确证延迟干预nNOS-PSD-95耦联能促进缺血皮层结构重塑,我在脑缺血后4-10 d给予Tat-nNOS-N_1-133,11 d取样,进行高尔基染色。结果表明,Tat-nNOS-N_1-133能够逆转由缺血带来的树突棘密度、树突分支数和树突长度降低;它也能提高损伤周围区Synapsin和PSD-95的表达,与形态学结果相吻合。ZL006与Tat-nNOS-N_1-133有类似的效应,也能够提高脑缺血组织的树突棘密度。更重要的是,经过nNOS-PSD-95解耦联后突触功能也有所增强,因为ZL006能够提高损伤周围区神经元的微小型兴奋性突触后电流（miniature excitatory post-synaptic currents,mEPSCs）的频率。而延迟干预nNOS-PSD-95耦联并不影响缺血周围区的梗死体积、神经元存活和神经发生。综上所述,延迟干预nNOS-PSD-95耦联降低紧张型抑制促进脑缺血后功能恢复是通过促进损伤周围区结构重塑,增强突触功能来实现的。第三章延迟干预nNOS-PSD-95耦联促进功能修复的分子机制本章研究了延迟干预nNOS-PSD-95耦联促进功能恢复的分子机制。首先,我们通过免疫组织化学标记,发现脑缺血后期损伤周围区星形胶质细胞大量激活并且高表达GABA,而神经元上GABA水平没有变化。然后我们采用Western blot法检测了特异性存在神经元和星形胶质细胞上的GABA转运子-1（GABA transporter-1,GAT-1）和GABA转运子-3/4（GABA transporter-3/4,GAT-3/4）的表达时程,结果显示在脑缺血后1-7 d GAT-1表达下降而GAT-3/4表达上升。以上结果提示,星形胶质细胞中的GAT-3/4对脑缺血后紧张型抑制水平的增加起着关键作用。为验证这一猜想,在脑缺血后4-10 d我们向损伤周围区注射GAT-1阻断剂NO-711或GAT-3/4阻断剂SNAP-5114,我们发现只有SNAP-5114能改善脑缺血小鼠的失足率和不对称指数。这就证实GAT-3/4参与了脑缺血后紧张型抑制的调控,影响了功能恢复。由于星形胶质细胞中GABA水平异常增高以及阻断GAT-3/4能脑缺血后促进功能恢复,因此我们猜想脑缺血后GAT-3/4发生功能反转由摄取GABA转变为释放GABA。我们通过电生理学实验发现,生理状态下给予SNAP-5114后I _tonic增加,GAT-3/4处于重摄取状态;脑缺血造模后给予SNAP-5114后I _tonic降低,GAT-3/4发生功能反转,释放GABA。这个结果表明脑缺血后GAT-3/4发生功能反转。非常有趣的是,Tat-nNOS-N_1-133能够逆转脑缺血模型下SNAP-5114带来的I _tonic降低;并且在行为学上,SNAP-5114能够取消AAV-nNOS-N_1-133-GFP对小鼠运动功能的改善作用。这些结果提示nNOS-PSD-95解耦联抑制脑缺血后GAT-3/4功能反转。而nNOS-PSD-95解耦联对GAT-3/4功能的影响是通过抑制星形胶质细胞激活和GABA表达来实现的。因为,免疫荧光标记结果表明Tat-nNOS-N_1-133或ZL006治疗能抑制星形胶质细胞激活标记物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和GABA的表达;我们通过Western blot法检测发现脑缺血后星形胶质细胞中GABA合成酶谷氨酸脱羧酶-67（glutamic acid decarboxylase 67,GAD67）和单胺氧化酶-B（monoamine oxidase B,MAOB）表达增加,而Tat-nNOS-N_1-133治疗后能抑制这两个酶的表达。在电生理学实验中AAV-nNOS-N_1-133-GFP与Tat-nNOS-N_1-133有类似的效应,给予SNAP-5114后I _tonic升高,星形胶质细胞激活剂脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）能够取消AAV-nNOS-N_1-133-GFP对GAT-3/4功能反转的抑制作用。由于nNOS-PSD-95解耦联后必然会引起NO的生成减少,因此我们又研究了NO对GABA水平的调控作用。首先,我们发现nNOS特异性抑制剂vinyl-l-N-5-（1-imino-3-butenyl）-l-ornithine（L-VNIO）与Tat-nNOS-N_1-133一样能抑制星形胶质细胞激活。但是这两者合用并没有增强其抑制作用,这个结果提示L-VNIO与Tat-nNOS-N_1-133是通过共同的下游NO信号来起作用的。在细胞水平上,我们证实神经元经过OGD造模后NO生成增加,Tat-nNOS-N_1-133能减少NO生成,而L655,708对其并没有影响;另外,NO供体使星形胶质细胞高表达GAD67、MAOB、GABA。最后,染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）和亚硝基化结果显示,脑缺血后nNOS-PSD-95耦联增强,使得NO生成增多,促进星形胶质细胞中蛋白亚硝基化,使得组蛋白乙酰化水平增加,增强Gad1和MAOB基因启动子区域乙酰化作用,促进GAD67和MAOB表达,而这个作用能被Tat-nNOS-N_1-133取消。综合以上研究表明:（1）延迟干预nNOS-PSD-95耦联能降低紧张型抑制,并促脑缺血后功能恢复;（2）延迟干预nNOS-PSD-95耦联能提高损伤周围区结构重塑,增强突触功能;（3）nNOS-PSD-95解耦联减少NO产生,抑制星形胶质细胞激活和GABA表达,逆转病理状态下的GAT-3/4功能反转,降低缺血周围区紧张型抑制,从而促进脑缺血后功能恢复。