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1.目的本研究的目的是为了鉴定鲍曼不动杆菌AbS分泌的N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)分子类型及其AHLs对细菌耐药的影响2.内容和方法本研究分为3部分(1)鉴定鲍曼不动杆菌AbS分泌的AHLs分子类型。首先,利用根癌农杆菌KYC55平行划线培养观察鲍曼不动杆菌AbS是否能够分泌AHLs分子;然后,将AbS培养4、8、16、24、32、40、48H的AHLs提取物和根癌农杆菌KYC55共同培养,检测β-半乳糖苷酶活性来建立AbS的AHLs活性时间曲线;最后,根据AHLs活性时间曲线选择时间点采样,利用高效液相色谱质谱分析(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)鉴定AHLs分子,同时用标准品验证。(2)构建鲍曼不动杆菌AbS的AHLs分泌缺陷菌株AbS-M。首先,将质粒p KNG101.aba I::Km转入大肠杆菌SM10构建大肠杆菌SM10/p KNG101.aba I::Km;然后,将大肠杆菌SM10/p KNG101.aba I::Km和鲍曼不动杆菌AbS通过接合法质粒转移实验构建AbS-M;最后,利用PCR电泳、AHLs活性检测、激光共聚焦显微镜观测AbS和AbS-M的区别。(3)观察AHLs对AbS耐药的影响。首先,肉汤稀释法检测美罗培南、哌拉西林、头孢他啶、环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、米诺环素对于AbS、AbS-M、AbS-M+AHLs的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);然后,在美罗培南诱导下,实时荧光定量PCR比较AbS、AbS-M、AbS-M+AHLs的耐药基因OXA-51、Amp C、Ade A、Ade B、OXA-23、IMP-4、VIM-2、Ade C的表达。数据用SPSS 19.0统计软件采用t检验和方差分析3.结果(1)平行划线培养有蓝色显示,证明AbS能够分泌AHLs;AbS的AHLs在培养时间4H时活性较低(5.00±1.00 Miller Units),到8H时达到高峰(279.33±27.59 Miller Units),随后又随着时间延长逐渐下降(16H:28.67±4.16 Miller Units),而菌液的OD600在24H到达高峰(0.90±0.01),后逐步进入平台期;HPLC-MS鉴定结果证明,鲍曼不动杆菌AbS能分泌一种AHLs信号分子,即N-3-OH-C12-HSL。(2)成功构建鲍曼不动杆菌AbS的AHLs分泌缺陷菌株AbS-M。并通过PCR电泳和AHLs活性检测进行验证。PCR电泳结果,AbS在400bp左右的位置可见一条带,而AbS-M在400bp没有条带;AHLs活性比较,缺陷株AbS-M的AHLs活性(12.67±1.53 Miller units)明显低于野生株AbS(255.67±16.01 Miller units)(P<0.01);激光共聚焦显微镜下观察,AbS镜下游离较少,大多聚集成团,AbS-M镜下大多游离,聚集成团较少;激光共聚焦显微镜检测AbS和AbS-M生物膜厚度,缺陷株AbS-M(5.96±0.56μm)明显低于野生株AbS的生物膜厚度(7.75±0.48μm)(P<0.05)。(3)美罗培南(0.25μg/ml),哌拉西林(1μg/ml)对于缺陷株AbS-M的MIC低于对于野生株AbS的MIC(美罗培南,0.5μg/ml;哌拉西林,2μg/ml),缺陷株AbS-M加入AHLs后美罗培南(0.5μg/ml)、哌拉西林(2μg/ml)对于AbS-M的MIC又有所增加。头孢他啶、环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、米诺环素的MIC,AbS,AbS-M,AbS-M+AHLs三组之间没有区别。基因OXA-51、Amp C、Ade A、Ade B在AbS,AbS-M,AbS-M+AHLs三组菌株均有表达,其中AbS-M即AHLs分泌缺陷株的耐药基因表达量(OXA-51,0.68±0.04;Amp C,0.60±0.04;Ade A,0.59±0.08;Ade B,0.51±0.09)明显低于野生株AbS(OXA-51,1.09±0.13;Amp C,0.94±0.11;Ade A,1.17±0.17;Ade B,1.08±0.16),而缺陷株AbS-M加入AHLs标准品后耐药基因表达(OXA-51,1.74±0.04;Amp C,1.55±0.04;Ade A,1.66±0.25;Ade B,1.31±0.11)又明显上升。OXA-23、IMP-4、VIM-2、Ade C表达3组均未检测出。4.结论我们利用HPLC-MS,明确了AbS的QS系统仅仅分泌一种AHLs信号分子:N-3-OH-C12 HSL;在美罗培南诱导下,N-3-OH-C12 HSL能够影响耐药基因OXA-51、Amp C、Ade A、Ade B的表达,抑制N-3-OH-C12 HSL的活性会降低OXA-51、Amp C、Ade A、Ade B的表达,增加N-3-OH-C12 HSL的活性会提高OXA-51、Amp C、Ade A、Ade B的表达,从而影响细菌耐药,同时在美罗培南诱导下,AHLs促使Ade A、Ade B表达的增加可能会导致AbS逐步对多种抗菌药物产生耐药,使细菌向泛耐药菌株转化。