虾青素（3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素）是一种脂溶性酮类类胡萝卜素,具有超强的天然抗氧化活性,广泛应用于食品、医药、化妆品、保健品和养殖业。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是商业化生产天然虾青素的优质生物资源。然而,成本高、效率低,依然制约着雨生红球藻虾青素规模化生产,难以满足快速增长的市场需求。培育富集虾青素的农作物新种质,以用作生物反应器,高效生产虾青素则是极具发展前景的热点领域,有助于我国功能农业和大健康产业的发展。为此,本文系统分析雨生红球藻生长及表征胁迫条件下雨生红球藻虾青素合成及相关代谢动态变化,以期揭示虾青素富集及其调控关键因素;系统解析细胞自噬参与调控雨生红球藻胁迫条件下,虾青素富集及相关生理生化过程,以期阐明虾青素生物合成及调控的分子机制和挖掘关键基因;以高生物量烟草（Nicotiana tabacum）为宿主,应用基因工程组装虾青素生物合成途径,以期培育营养器官富含虾青素的烟草新种质,用于高效生产天然虾青素。主要研究结果如下:1.高光、高温和缺氮是诱导雨生红球藻虾青素富集的三个重要胁迫因子。分别表征雨生红球藻生长及在高光（≥7000 lx）、高温（≥30℃）、缺氮（0 N）及三重胁迫条件下,虾青素积累及其他相关代谢的时空响应,以建立调控虾青素富集的有效技术。试验数据揭示,诱导藻细胞积累虾青素效应强弱为:三重诱导＞高光＞无氮＞高温。胁迫诱发细胞自噬、形成自噬泡。胁迫条件下,细胞自噬与虾青素积累、油脂合成及活性氧产生同步增强;脯氨酸含量由对照的12.61 μg/mg,上升到812.65μg/mg,增加了 64.4倍（P＜0.01）;钙（Ca）、铁（Fe）和镁（Mg）含量亦显著增加（P＜0.05）。这些细胞生理生化的改变提高藻细胞抗逆性。2.为阐明细胞自噬介导胁迫条件下,虾青素合成积累调控机制,应用细胞自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-MA,3-methyladenosine一种能有效地抑制自噬发生的化合物）处理高光胁迫培养的雨生红球藻,分析细胞自噬抑制对细胞生长、虾青素合成、油脂代谢等效应。试验结果显示,3-MA（0.02 mM）能有效地抑制自噬体形成,但不影响雨生红球藻细胞生长和生物量的积累（P＞0.05）。抑制细胞自噬导致细胞活性氧（ROS）大量增加（P＜0.01）,以及虾青素、油脂和棕榈酸高水平富集（P＜0.05）。3-MA处理的藻细胞虾青素合成关键酶基因即八氢番茄红素合成酶（PSY,phytoene synthase）、β-胡萝卜素酮化酶（CRTO,β-carotene ketolase）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-b,β-carotene hydroxylase）基因表达显著高于对照藻细胞的数倍（P＜0.05）。然而,油脂合成相关基因即生物素羧化酶（BC,biotin carboxylase）和二酰基甘油酰基转移酶（HpDGAT2D,diacylglycerol acyltransferase）基因表达与对照藻细胞相比仅小幅上调。在强光胁迫下,细胞自噬抑制导致的雨生红球藻虾青素积累与油脂生物合成呈不完全线性关系。研究表明细胞自噬参与藻细胞虾青素及油脂生物合成积累的调控,以及PSY、CRTO和CRTR-b是控制虾青素合成的关键酶基因。3.为进一步验证PSY、CRTO（BKT）和CRTR-b（BHY）酶基因是否能在异源宿主行使功能、促进虾青素富集,分别构建来自莱茵衣藻（C.reinhardtii）的CrBKT和来自雨生红球藻（H.pluvialis）的HpBHY以及来自玉米（Zea mays L.）的ZmPSY酶基因的过表达载体,应用农杆菌介导烟草叶组织瞬时表达这些目的基因。烟叶组织生化测试发现,这些外源目的基因过表均能促进虾青素或类胡萝卜素富集。特别是共表达HpBHY+CrBKT基因5d烟草叶片不仅虾青素含量高达0.518 μg/mg（干重）,而且叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素也显著增加至10.33 μg/mg,3.012 μg/mg和2.271μg/mg（P＜0.01）,预示着虾青素富集至少未减低烟叶正常光合作用。4.选用瞬时表达促进烟叶富集虾青素效果最显著的HpBHY和CrBKT酶基因,通过农杆菌介导叶盘转化法将这两个基因转入普通烟草,以期在烟草中组装虾青素合成途径。HpBHY和CrBKT酶基因前端分别融合来自烟草的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基（rbcS）的转运肽（NtTp）,以使目的酶蛋白定位于质体。此外,分别采用花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子和拟南芥ubq10启动子驱动NtTpCrBKT和NtTpHpBHY过表达。经分子检测获得了HpBHY和CrBKT目的基因共转化的19个独立转基因烟草株系,其中13个转基因烟草株系的HpBHY和CrBKT基因能有效转录表达。转基因烟草株系表型鉴定揭示,T0代植株花部蜜腺由野生型的亮黄色变为橘色或红色,叶片由野生型的绿色变为紫红色。共同过表达HpBHY和CrBKT能使T1代45日龄烟叶积累虾青素达7.82 mg/g,总类胡萝卜素由野生型的4.23 mg/g增加到8.47 mg/g。转基因株系叶绿素由野生型的22.76 mg/g降低到16.45 mg/g,但光合作用未受显著影响。双基因共表达的转基因烟草株系抵抗紫外线和干旱胁迫能力显著增强,植株生长发育等其它农艺性状未现负效应。5.为进一步提高虾青素在异源烟草宿主的富集量,选用能调控类胡萝卜素合成途径上游基因PSY、PDS（八氢番茄红素脱氢酶,Phytoene desaturase）、LCYb（番茄红素β-环化酶,Lycopene β-cyclses）及下游降解类胡萝卜素基因CCD1（类胡萝卜素裂解双加氧酶 1,Carotenoid cleavage dioxygenase1）的转录因子 CsMADS6（来自柑橘）与上述两个酶基因HpBHY和CrBKT构建共表达载体。选用来源于农杆菌Ti质粒具有植物启动子特性的甘露碱合成酶基因启动子mas驱动CsMADS6表达。将三基因共表达载体,经农杆菌介导遗传转化普通烟草。经分子检测,获得了HpBHY、CrBKT和CsMADS6三个基因共转化的19个独立的转基因烟草株系,其中16个转基因烟草株系的HpBHY、CrBKT和CsMADS6能有效转录表达。转基因烟草株系表型鉴定揭示,T0代植株花部蜜腺由野生型的亮黄色变为橘色或红色,叶片由野生型的绿色变为紫红色,花苞期的萼片由野生型的绿色变为橘红色。共表达HpBHY、CrBKT和CsMADS6 T1代45日龄烟叶积累虾青素高达10.32 mg/g,总类胡萝卜素由野生型的4.23 mg/g增加到12.81 mg/g,相应的叶绿素由野生型的22.76 mg/g降低到14.94 mg/g。烟叶光合活性及植株生长发育等农艺性状与野生型烟草相比未现显著差异（P＞0.05）。此外,三基因共表达的转基因烟草株系抵御干旱及紫外胁迫能力显著增强。6.为深入解析三个靶基因协同表达,对异源烟草宿主全基因组相关基因表达的影响,特别是对类胡萝卜素生物合成代谢相关基因,以及类胡萝卜素合成相关生理生化过程的全局效应。选择三个目的基因高表达、且高产虾青素的转基因株系（BBC）和对照野生型（CK）烟草为试材,进行转录组学和类胡萝卜素靶向代谢组学联合分析。在转基因和野生型烟草烟叶共检测到33种类胡萝卜素（胡萝卜素6种,类胡萝卜素酯15种和叶黄素12种）,转基因烟草主要富集的类胡萝卜素包括虾青素（Astaxanthin）、叶黄素（Lutein）和β-胡萝卜素（β-carotene）,占总类胡萝卜素的94.15%;野生烟草检测到的主要类胡萝卜素包括叶黄素、β-胡萝卜素和新黄质（Neoxanthin）,占总类胡萝卜素的87.91%。外源β-胡萝卜素羟化酶（HpBHY）强表达,导致其酶蛋白催化生成的β-隐黄质（β-Cryptoxanthin）和玉米黄质（Zeaxanthin）含量上升,尽管该外源基因表达引起烟草内源β-胡萝卜素3-羟化酶2（BCH2,beta-carotene 3-hydroxylase 2）基因下调表达。外源HpBHY和CrBKT共同催化生成了烟草原本不能合成的角黄质（Canthaxanthin）、海胆酮（Echinenone）和目标产物虾青素的合成及大量富集。基因共表达分析表明,三基因共表达的转基因烟草株系,其目标产物虾青素的高量积累与烟草内源类胡萝卜素代谢通路的9个关键基因（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、番茄红素ε-环化酶和ζ-胡萝卜素脱氢酶等）共表达正相关。而烟草内源β-胡萝卜素3-羟化酶2（BCH2）和催化类胡萝卜素代谢通路另一分支终产物新黄质生成的基因新黄质合成酶（NXS,neoxanthin synthase）以及催化脱落酸（Abscisic acid,ABA）生成的基因9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED1,9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase）共表达与虾青素合成积累负相关。此外,与野生型烟草相比,脂肪酸/油脂合成途径大部分基因在转基因株系烟叶上调表达。这说明,虾青素富集与油脂合成显著关联。本研究揭示了细胞自噬参与胁迫诱导雨生红球藻虾青素富集的调控,丰富了有关虾青素生物合成调控机制的认知。以控制虾青素生物合成的两个来源于微藻的关键酶基因HpBHY、CrBKT和来源于柑橘的调控类胡萝卜素途径多个酶基因的转录因子CsMADS6为靶标,在高生物量烟草中成功组装虾青素富集途径,培育获得高水平富集虾青素的烟草新种质。研究发现为建立优化的雨生红球藻虾青素生产体系和应用烟草生物反应器可持续高效生产虾青素以及基于虾青素的多种功能强化产品的商业化提供了理论和技术支撑,亦为合成生物学中复杂代谢工程的解析和植物农艺性状改良提供了科学参考。